潘翠萍等

摘 要 以‘大五星枇杷花药培养获得的子叶胚为材料，研究基本培养基、蔗糖浓度、4 ℃低温处理、饱和CaCl2脱水处理、“4℃低温+饱和CaCl2脱水”处理对胚状体成苗的影响，并优化枇杷花药培养及植株再生技术体系。结果表明：枇杷花药胚状体经“4 ℃低温+饱和CaCl2脱水”预处理7 d效果最佳；将预处理后的胚状体种于萌发培养基1/2MS+3%蔗糖，胚状体成苗率最高，为78.2%；将再生植株移栽入配比为腐熟有机肥 ∶ 园土 ∶ 锯末=1 ∶ 2 ∶ 1的基质中时，组培苗移栽成活率达85.25%。

关键词 枇杷；花药培养；子叶胚；成苗

中图分类号 S667.3 文献标识码 A

Abstract The anther-derived cotyledon embryoid of loquat（Eriobotrya japonica Lindl. cv. ‘Dawuxing）was used as material to optimize the plant regeneration system. A series of experiments were carried out to investigate the effects of basic medium， sucrose concentrations， 4 ℃ low temperature pretreatment， saturated CaCl2 dehydration pretreatment and“4 ℃ low temperature + saturated CaCl2 dehydration”pretreatment on plantlet formation of microspore embryoid in Loquat. The results showed that after pretreatment in“4 ℃ low temperature+ saturated CaCl2 dehydration ” for 7 days， the plantlet formation rate was the highest. 78.2% of complete plantlets were succesfully obtained on 1/2 MS medium supplemented with 3.0% sucrose after the embryos were pretreated for 7 days in “4 ℃ cryogenic treatment and saturated CaCl2 dehydration”. The complete plantlets survived at a rate of 85.25% in the transplantation matrix of decomposed organic fertilizers， garden soil and sawdust（1 ∶ 2 ∶ 1）.

Key words Loquat；Anther culture；Cotyledon embryoid；Plantlet formation

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.09.019

枇杷童期长，基因杂合度高，常规育种周期长，可达10～20 a[1]。近年来日趋完善的遗传转化技术为枇杷的育种开辟了一条新途径[2]。枇杷遗传转化工作一直都受到关注，但是进展相当缓慢，外植体再生难度大且遗传转化方法及条件均未成熟[3]，国内外尚未见枇杷转基因植株成功的报道。

植物遗传转化的众多研究已经证明，胚状体是理想的遗传转化受体系统[4]。迄今为止，转基因果树多是通过胚状体发生途径获得的[5]。有关枇杷花药胚状体方面的报道较少，李俊强[6]初步建立了枇杷花药培养及植株再生技术体系，随后，秦红玫[7]和杨志武[8]对枇杷花药胚胎的发生及发育过程进行了组织细胞学观察，并对枇杷花药胚状体的诱导及成苗条件进行了筛选，但胚状体成苗率低的问题一直未能得到很好解决，限制了该项技术的广泛应用。

因此，本实验以‘大五星枇杷花药培养获得的子叶胚为材料，对影响枇杷花药胚成苗的因素进行了优化，完善了枇杷花药胚状体再生技术体系，为利用基因工程手段进行枇杷种质改良奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

‘大五星枇杷花药胚状体保存于四川农业大学生物技术研究中心实验室，保存培养基为MS+ ZT 0.05 mg/L+NAA 0.02 mg/L+IBA 0.02 mg/L+琼脂7.5 g/L+蔗糖30 g/L，选取子叶胚为试材（图1-A）。

1.2 方法

1.2.1 胚状体的萌发成苗 ①不同预处理方式对胚状体萌发成苗的影响。选取长势基本一致的‘大五星枇杷花药子叶胚，进行萌发前预处理：（1）4 ℃低温处理：设置7、14、21、28、35、42 d共6个时段（人工气候箱调节），以不作处理为对照；（2）饱和CaCl2脱水处理：将子叶胚置于饱和CaCl2 环境条件下，设置5个时间段1、3、5、7、9 d，以不作处理为对照； （3）“饱和CaCl2脱水+4 ℃低温”处理：将胚状体置于饱和CaCl2环境条件下，同时进行4 ℃低温处理，处理时间设置为1、3、5、7、9、11 d，6个时段，以不作任何处理为对照。所有处理完成后将花药胚转入成熟、萌发培养基1/2 MS+蔗糖30 g/L+琼脂7.5 g/L中。每个处理接种50个胚状体，重复3次，培养30 d后统计胚状体成苗率（萌发成完整植株的胚状体数/接种的胚状体数×100%）。

②基本培养基及蔗糖浓度对胚状体萌发成苗的影响。选取长势基本一致的‘大五星枇杷花药子叶胚，用筛选出的预处理条件进行预处理后接种于胚状体萌发培养基上，胚状体萌发基本培养设置为（MS、1/2MS）、添加不同浓度的蔗糖15、30、50 g。每个处理接种50个胚状体，重复3次，培养30 d后，统计胚状体成苗率（萌发的胚状体数/接种的胚状体数×100%）和长势。

1.2.2 再生植株的炼苗移栽 当再生小植株根长为3～5 cm时即可进行炼苗移栽，方法是在培养室揭去封口膜培养3 d，然后取出试管苗洗去培养基，移栽到含有不同配比的基质中，每种基质移栽30株，重复3次，常规管理，30 d后统计移栽成活率（移栽成活的组培苗数/移栽组培苗数×100%）。

1.2.3 培养条件 培养温度（25±1）℃，光照时间14 h/d，光照强度为30 μmol/（m2·s）。

1.3 数据分析

所得数据用DPS 7.05软件进行统计分析，多重比较采用Duncan新复极差法。

2 结果与分析

2.1 胚状体的萌发成苗

2.1.1 不同预处理对胚状体萌发的影响 胚状体不进行预处理，形成完整植株的百分率低（5.3%～6.0%），大部分胚状体仅形成了根（42.5%～45.1%），而没有芽的分化。少部分胚状体仅形成了芽（7.5%～8.6%），而没有根的分化。可见，胚状体的发育有3种情况：仅形成根，而不分化出芽（图1-B）；仅分化出芽，而不形成根（图1-C）；既分化出根又分化出芽，形成完整植株（图1-D～E）。

不同预处理方式对枇杷花药胚状体成苗率的影响有较大差异。3种预处理方式（4℃低温处理、饱和CaCl2脱水处理、“4℃低温+饱和CaCl2脱水”处理）均能显著提高胚状体的成苗率，随着处理时间的延长，3种处理方式胚状体的成苗率均呈现出先增加后降低的趋势，当4℃低温处理时间为28 d时，胚状体成苗率为62.4%，显著高于其它低温各处理（表1）；饱和CaCl2脱水处理7 d时，胚状体成苗率为50.4%，为脱水处理中最高（表2）；对枇杷胚状体进行“4 ℃低温+饱和CaCl2脱水”处理7 d时，胚状体成苗率高达76.6%，为所有处理中最高（表3）。综上所述，“4℃低温+饱和CaCl2脱水”处理7 d，为枇杷胚状体成苗最佳的预处理方式。

2.1.2 基本培养基和蔗糖浓度对胚状体的萌发成苗的影响 基本培养基和蔗糖浓度对枇杷胚状体成苗的影响见表4。当基本培养基一定时，胚状体成苗率随着蔗糖浓度的升高（1.5%～5.0%），呈现出先上升后降低的趋势。当蔗糖浓度为3.0%时，成苗率高，达72.5%（MS）和78.2%（1/2MS））； 当蔗糖浓度为5.0%时， 成苗率较低，为47.5%（MS）和40.1%（1/2MS）；当蔗糖浓度为1.5%时，成苗率居中， 为50.4%（MS）和55.3%（1/2MS）。为进一步分析基本培养基和蔗糖浓度对胚状体成苗率影响的差异性，对胚状体成苗率进行了F检验，结果表明：蔗糖浓度对胚状体成苗的影响达到了极显著水平（F=510.77，p<0.01），而基本培养基对胚状体成苗的影响则不显著，F值为1.32。多重比较结果显示，蔗糖浓度为3%时，胚状体成苗率最高，极显著高于其它处理。综上所述，枇杷花药胚状体萌发的适宜培养基为1/2MS+3%蔗糖。

2.2 再生植株的炼苗移栽

经炼苗移栽后的生根小植株，在不同的移栽基质里植株成活率和植株长势差异较大。从表5可看出，移栽基质配比为腐叶土 ∶ 珍珠岩=3 ∶ 1时，组培苗移栽成活率为45.62%，植株叶片小，茎杆细，叶色泛黄，长势弱；移栽基质配比为腐熟有机肥 ∶ 园土 ∶ 锯末=1 ∶ 2 ∶ 1时，组培苗移栽成活率达85.25%，植株叶片大，茎杆粗壮，叶色深绿，长势健壮（图1-E）。由此可见，腐熟有机肥 ∶ 园土 ∶ 锯末=1 ∶ 2 ∶ 1为枇杷生根组培苗移栽的适宜基质。

3 讨论与结论

植物花药培养中胚状体成苗率低甚至得不到再生植株的现象比较普遍[9]。许多物种存在胚状体质量差，成熟度不高，抗性低等问题，最终造成了成苗率低[10]。因此，对胚状体进行萌发前预处理就显得尤为重要。

据文献报道，促进胚状体萌发的方法很多，如植物激素浸泡处理[11]，胚状体形态筛选[12]，低温处理[13]，脱水处理[14-15]，在培养基中添加植物生长调节剂或其它物质[16]以及液体培养[17]等。李俊强等[6]报道枇杷花药胚状体较难成苗，正常情况下仅有5%的胚状体能够形成完整植株，秦红枚[7]研究认为枇杷花药胚状体经一定时间脱水处理后其成苗率比对照提高了14.9%。本实验系统探讨了低温处理（4 ℃）、饱和CaCl2脱水处理以及‘4 ℃低温+饱和CaCl2脱水处理对胚状体成苗的影响，结果表明：未经处理的枇杷胚状体形成完整植株的比率低，为5.3%～6%。对胚状体进行一定时间的低温处理（4 ℃）、饱和CaCl2脱水处理以及‘4 ℃低温+饱和CaCl2脱水处理均能有效的提高胚状体的成苗率，其中以‘4 ℃低温+饱和CaCl2脱水处理7 d效果最佳，其成苗率为76.6%。

研究表明，胚状体成熟时，除了形态和结构发育外，还需要积累一定的能源物质（淀粉和多糖的积累），从而起到为新发育阶段提供能量的作用[18]。通常认为脱水处理能使胚状体诱导产生代谢停滞的状态，从而使许多物种胚状体能够长时间贮藏，同时，脱水过程中水分的丢失被认为是建立对干旱耐受性的信号[15]。

Pond等[19]研究表明，低温处理可以部分地替代脱水处理，在脱水时同时进行低温处理增强了体胚的抗逆性，从而促进了胚的萌发。

本研究以‘大五星枇杷花药子叶胚为材料，完善了‘大五星枇杷花药培养及植株再生技术体系，为利用转基因技术对体枇杷进行遗传改良奠定了一定的基础。

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