黄丹丹等

摘 要 以短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX基因组DNA为模板，通过PCR扩增得到几丁质酶基因chiD序列，再将chiD序列连接到pMD18-T克隆载体上，形成重组载体pMD18-T-chiD，转化大肠杆菌DH5ɑ并测序，经过核苷酸和氨基酸序列分析获得几丁质酶基因chiD的序列片段为1 524 bp，编码507个氨基酸，理论蛋白质分子量约54.55 ku，其等电点约为5.77，表明该几丁质酶为酸性几丁质酶。将重组质粒pMD18-T-chiD双酶切后与表达载体pET-28a连接，构建重组表达载体pET28a-chiD，并转入大肠杆菌BL21中进行IPTG诱导表达，结果表明：重组蛋白质的分子量约55 ku，与预测的蛋白分子量结果一致。为了提高重组蛋白的表达量，对培养时间、IPTG浓度和温度3个参数进行优化，并将表达产物进行SDS-PAGE分析，最后得出重组载体pET28a-chiD的最佳诱导表达参数分别为8 h、0.5 mmol/L和28 ℃。这为短短芽胞杆菌来源的几丁质酶的进一步研究奠定了良好基础。

关键词 短短芽胞杆菌；几丁质酶基因；克隆；表达；IPTG诱导

中图分类号 R378 文献标识码 A

Abstract The chromosome DNA from Brevibacillus brevis FJAT-0809-GLX was treated as a template to obtain chiD chitinase gene by PCR amplification. The recombinant plasmid pMD18-T-chiD was constructed by lingking gene chiD sequence and plasmid pMD18-T. Nucleotides and amino acids sequence of chitinase gene was analyzed and the results showed that gene chiD was 1 524 bp encoding a 54.55 ku protein of 507 amino acids with pI 5.77. The chitinase gene from the recombinant plasmid was linked with the expression vector pET-28a digested with the same two restriction enzymes， and the recombination expression vector pET28a-chiD was conctructed. And the expression vector was transformed into E.coli BL21（DE3） successfully. In order to improve protein expression index， the recombinant expression vector was induced to express and the expression product was detected by SDS-PAGE electrophoresis. The results indicated that the expressed protein molecular weight was about 55 ku， which was consistent with the prediction result. The vector pET28a-chiD was induced to express with different cultural time， isopropyl-p-D-thiogalactopyranoside（IPTG） concentrations and temperature， and the results showed that the best inducing parameters were 8 hours， 0.5 mmol/L and 28 ℃. It would lay a good foundation for the further research of chiD chitinase from B. brevis FJAT-0809-GLX.

Key words Brevibacillus brevis；Chitinase gene；Clone；Express；IPTG induction

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.09.017

几丁质是由N-乙酰-D氨基葡萄糖以β-1，4糖苷键连接而成的线性高分子聚合物[1]，广泛存在于甲壳类生物、昆虫的外壳及真菌的细胞壁中[2]。几丁质酶是一种能够降解几丁质的内切酶，具有一系列复杂的结构[3]，主要由糖苷水解酶18家族和19家族的成员组成，其中大多数植物和放线菌产生的几丁质酶属于19家族，而真菌产生的几丁质酶属于18家族[4]。其作用机制为：首先由内切几丁质酶将几丁质水解成为由N，N-二乙酰壳二糖苷组成的小分子低聚糖，再由外切β-N-氨基葡萄糖苷酶将这些低聚糖降解为β-1，4-N-乙酰-D-葡萄糖胺[5]。几丁质酶能够分解昆虫围食膜和细胞壁中的几丁质，破坏昆虫和病原真菌的防御系统，提高植物的自我防御能力，抑制病原菌的生长，促进农业生产和环境保护。

国内外已有许多文献报道，将微生物几丁质酶基因成功的在工程菌中克隆和重组表达。Driss等[6]将几丁质酶成功应用于Bacillus thuringiensis细胞外毒素的重组表达以增强其抗虫活性。Hu等[7]将苏云金芽胞杆菌中的几丁质酶基因和毒蛋白基因整合在一起进行组成型表达，以增加毒蛋白对农业害虫的毒害作用。王焰玲等[8]研究环状芽胞杆菌C-2中的几丁质酶基因序列在枯草芽胞杆菌中表达，分析其序列同源性，并作了重组枯草芽胞杆菌对稻瘟病菌的抑菌试验，其抑菌效果相对于无几丁质酶活性的枯草芽胞杆菌提高了46.38%。黄玉杰等[9]也将枯草芽胞杆菌中的几丁质酶基因转入伯克氏菌中，构建含有重组表达载体pRChi113的工程菌，检测到其对大丽花轮枝孢、立枯丝核菌、麦根腐长蠕孢、和谷丝核菌的抑制效果明显提高。本研究结合相关文献，预将本实验室保存的一株具有抑菌活性的革兰氏阳性菌[10]短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX中的几丁质酶基因进行克隆，并在大肠杆菌中表达，结合基因和氨基酸序列预测分析，以获得一个新的几丁质酶基因序列和其一级结构信息，为短短芽胞杆菌来源的几丁质酶的进一步研究奠定了良好基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株与质粒 短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX、大肠杆菌DH5α由本实验室菌种库保存，大肠杆菌BL21（DE3）为福建省农业科学院植物保护研究所陈庆河研究员馈赠；载体pMD18-T购于Takara生物科技有限公司，pET-28a由福建省农业科学院土壤与肥料研究所贾宪波馈赠。

1.1.2 酶与试剂 限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ购自Takara生物有限公司，细菌基因组DNA提取试剂盒购自BioTeke公司，dNTPs购自北京天根生物有限公司，3 000 bp marker购自ferments生物有限公司，Mini Plasmid extraction kit购自OMEGA生物有限公司；X-Gal 和IPTG使用终浓度分别为2%和20%，氨苄青霉素和卡那霉素终浓度均为50 μg/mL。

1.2 方法

1.2.1 引物与PCR扩增 以短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX全基因组测序得到的几丁质酶开放阅读框为模板，设计特异性引物，引物两端分别添加BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点，特异性扩增几丁质酶基因chiD，引物序列为：chiD01 F′：5′-CGCGGATC

CATGTATTTTTTGATGAGAAAAGC-3′和chiD02R′：5′-CCGCTCGAGTGACTTAATGAATCAAGCGAACT-3′。以短短芽胞杆菌全基因组DNA（按照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书进行提取操作）为模板进行特异性PCR扩增，其扩增条件为： 94 ℃，预变性4 min；94 ℃变性1 min，60 ℃退火1 min， 72 ℃延伸1 min，共35个循环；72 ℃再延伸10 min，完成PCR的扩增程序。

1.2.2 几丁质酶基因的克隆 利用DNA凝胶回收试剂盒回收PCR扩增得到的几丁质酶基因序列产物，将其亚克隆到克隆载体pMD18-T上，16 ℃连接过夜后热击转化入感受态细胞大肠杆菌DH5α中，用含有40 μL 2% X-Gal、7 μL 20% IPTG和50 μg/mL氨苄青霉素的LB平板进行阳性克隆子的筛选，挑取白色克隆子作特异性PCR扩增验证，并提取阳性克隆质粒送至上海博尚生物科技有限公司测序。

1.2.3 重组表达载体pET28a-chiD的构建 以重组克隆载体pMD18-T-chiD为模板，chiD01和chiD02为引物，PCR扩增几丁质酶基因，扩增产物用PCR产物纯化试剂盒纯化后用限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ双酶切，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，然后用DNA凝胶回收试剂盒回收，与同样经过相同双酶切处理的表达载体pET-28a连接，连接产物热击转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，并利用含有终浓度50 μg/mL卡那霉素的LB固体平板筛选转化子，转化子经特异性PCR和酶切电泳鉴定，最后获得重组质粒pET28a-chiD，构建过程见图1。

从重组大肠杆菌DH5α中提取重组质粒pET28a-chiD，将其转化大肠杆菌BL21（DE3），得到的阳性转化子经特异性PCR和酶切电泳鉴定，最后获得阳性表达转化子。

1.2.4 几丁质酶的诱导表达条件优化 将阳性转化子转接入含50 μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，培养至OD值为0.8，加入不同浓度的IPTG，在不同诱导时间和温度下诱导重组表达转化子，并利用SDS-PAGE凝胶电泳分析确定最佳的诱导表达条件。其诱导条件见表1。

2 结果与分析

2.1 短短芽胞杆菌几丁质酶基因chiD核苷酸序列分析

将几丁质酶基因chiD序列提交到NCBI，获得登录号为KF894918。由表2可知，DNAman软件分析得到几丁质酶基因chiD的ORF序列片段长度为1 524 bp，G+C含量约占总量的49.7%，其双链dsDNA分子量为939.51。在NCBI上进行序列比较分析，得出本实验中短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX几丁质酶核苷酸序列与短短芽胞杆菌NBRC 10059几丁质酶基因chiD的核苷酸同源相似度分别为97%，且与蜡样芽胞杆菌NC7401、橙色标桩菌DW4/3-1、粘细菌DSM 2259、苏云金芽胞杆菌Al Hakam和炭疽芽胞杆菌A16的核苷酸均具有较高的同源性，结果见表2。

2.2 短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX几丁质酶的氨基酸序列分析

利用DNAman和ExPASy蛋白分析软件中的ProtParam、ScanProsite、SWISS-MODEL、InterProScan、NetNglyc 1.0 server和SOPMA等工具对所获基因推导的氨基酸序列进行在线分析，结果显示，几丁质酶基因编码507个氨基酸，蛋白质的相对分子量约为54.55 ku，理论等电点约为5.77，属于Ⅱ类几丁质酶和糖苷水解酶18家族。从几丁质酶基因编码的氨基酸序列比较来看，短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX与短短芽胞杆菌NBRC 10059、短芽胞杆菌BC25的同源性分别达到97%和93%，而与其他Ⅱ类几丁质酶序列的同源性在50%～65%。

几丁质酶基因编码的氨基酸序列见图2，在chiD的N端，首先为一段含有29个氨基酸的信号肽，该信号肽可被革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌及其他原核生物识别，革兰氏阴性菌的可识别断裂位点为Met-30和Phe-32，革兰氏阳性菌和其他原核生物的可识别位点为Met-30。其后第30～76氨基酸的间隔区域为酶底物结合区，也是糖苷水解酶5～12家族的保守区，其中芳香族氨基酸Tyr和Trp高度保守。第88～163个氨基酸间隔区域为一个纤连蛋白Ⅲ折叠区（Fibronectin， typeⅢ），之后第180～496氨基酸的间隔区域为该几丁质酶的酶催化区域，其中第183～487氨基酸为糖苷水解酶18家族的催化保守区，第286～294氨基酸为预测的蛋白质活性位点，Glu-294为一个质子供体。N-糖基化位点分析结果显示，氨基酸序列中存在8个天冬氨酸或天冬酰胺的N-糖基化位点，分别位于第91、143、158、193、231、259、309、491位氨基酸，在这些位点后皆存在跨膜螺旋Asn-Xaa-Ser/Thr序列。此外，蛋白质二级结构预测分析结果表明，该蛋白中存在ɑ-螺旋、延伸链、β-转角和无规则卷曲部分。

2.3 重组表达载体pET28a-chiD的构建

将经限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后的几丁质酶基因片段和同样经双酶切处理的表达载体pET-28a用T4连接酶进行连接，热击转化大肠杆菌DH5α，并对获得的重组表达载体pET28a-chiD作PCR和双酶切验证。由图3可知，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后，发现在约1 500 bp处显示有清晰条带，初步确定为阳性转化子。进一步对阳性克隆中的重组质粒进行提纯，用限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ双酶切，经1%琼脂糖凝胶电泳后，在约1 500 bp处出现清晰条带（图4），最终确定为阳性转化子，将获得的重组质粒送至博尚生物技术（上海）有限公司测序，结果显示序列匹配率为100%，说明在重组表达载体的构建过程中，几丁质酶基因已正确连接到表达载体pET-28a上，并未发生突变。

2.4 重组几丁质酶的诱导表达验证及其诱导条件优化

将重组表达载体转入大肠杆菌BL21（DE3）中，构建含几丁质酶基因的工程菌。通过不同的IPTG浓度、时间和温度诱导几丁质酶基因表达，并采用SDS-PAGE电泳检测酶的表达情况。由图5可知，当IPTG浓度为0.5 mmol/L，28 ℃下诱导表达8 h时（泳道1），在约55 ku处出现清晰的目标蛋白质条带（图5中所示），而阴性对照组（只含表达载体pET-28a的大肠杆菌BL21）在相应位置未出现目标条带，由此可确定重组表达载体pET28a-chiD表达成功。与此相反，其他诱导条件下的泳道中也出现目标条带，但其条带均较弱，蛋白浓度很低，由此表明最佳的诱导表达参数为8 h、0.5 mmol/L和28 ℃。另外，电泳检测结果中发现在分子量18、38 ku附近出现微弱的条带（见图5中泳道3、7、8、10、11所示），推测可能是几丁质酶的降解产物[11]。

3 讨论与结论

原核生物的基因片段一般为启动子序列、编码区和终止子序列，其编码区通常由分泌信号肽、酶催化区、粘连蛋白TypeⅢ同源区和底物结合区等4个基本功能区构成。许多细菌几丁质酶的氨基酸序列一般表现为N端催化区域，C端底物结合区域，甚至一些细菌的几丁质酶含有多个催化区域，如Howard等[12]研究发现microbulbifer degradans的几丁质酶B含有2个催化域，其中N端催化域对几丁二糖衍生物的降解速率为C端催化域的13.6倍，而C端催化域对几丁三糖的降解速率为N端催化域的2.7倍，N端催化域和C端催化域分别表现为外切几丁质酶和内切几丁质酶的活性。短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX的几丁质酶催化区在C端，底物结合区在N端，推断该几丁质酶表现内切几丁质酶活性，对几丁高聚糖产物的降解效果可能更好。同时，活性位点对蛋白酶的功能有着重要影响，糖苷水解酶18家族活性位点的共有基序为“DXDXE”[13-15]，短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX的几丁质酶中含有DLDLE基序，可见第290～294氨基酸为其活性位点的保守残基，该几丁质酶具有较好的催化活性。另外，信号肽序列在不同的细菌中表达时其剪切位点会出现差异[16-17]，夏启玉等[18]将一株香蕉内生细菌的几丁质酶基因克隆入大肠杆菌，构建含信号肽和不含信号肽的几丁质酶表达菌株，进一步检测发现两者在胞外均具有几丁质降解活性，得出此几丁质酶的信号肽能被BL21识别，将几丁质酶分泌到培养基中。本研究中预测几丁质酶基因chiD编码的蛋白信号肽在短短芽胞杆菌中的识别位点为Met-30， 在大肠杆菌中识别位点变为Met-30和Phe-32，且在重组大肠杆菌胞外也检测到几丁质酶活性为5.09 U/mL（文中未描述），推断大肠杆菌BL21可识别该几丁质酶的信号肽，并将其分泌到胞外。

几丁质酶基因chiD在载体pET-28a的T7启动子调控下能够诱导表达，且诱导条件不同，其重组工程菌的表达量不同。Ye等[19]将沙雷氏菌中的几丁质酶基因与表达载体pET-28a重组，并在大肠杆菌BL21（DE3）中进行诱导表达，通过SDS-PAGE电泳检测，得到其最佳诱导参数分别为4 h、0.5 mmol/L和25 ℃，几丁质酶的表达量在此条件下更大。而本实验中优化含有重组表达载体pET28a-chiD的大肠杆菌工程菌的表达条件，获得的最佳诱导参数分别为8 h、0.5 mmol/L和28 ℃，此条件下SDS-PAGE图谱中蛋白条带更明显，由此说明工程菌的生长时间和温度会影响重组酶的诱导表达，IPTG的添加浓度也会对表达量产生影响。另外，本实验重组表达的几丁质酶预测等电点约为5.77，呈现酸性，与短芽胞杆菌属其他亚种的碱性几丁质酶[20-21]存在差异，这说明短芽胞杆菌属细菌的几丁质酶有着多样性。

短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX具有较好的抑菌效果和果品保鲜作用[22-23]，其抑菌功能物质也有初步研究[23]，但对其几丁质酶的研究甚少。同时，由于短芽胞杆菌属细菌中几丁质酶的研究大多停留在分离纯化层面，关于其基因的分子克隆与重组表达的研究鲜见报道，因此本研究构建了短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX基因克隆和原核表达体系，为该几丁质酶基因的活性功能位点的研究奠定基础，为其它功能基因的研究提供平台，后续工作将对重组表达几丁质酶的相关酶学性质和功能调控机制做进一步的研究。

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