徐靖等

摘 要 根据EST序列信息，从海南普通野生稻中克隆了一个NAC（NAM， ATAF and CUC）类转录因子OrNAC5。该基因编码区cDNA长度699 bp，编码232个氨基酸，对应的DNA长度为2 538 bp，含有3个外显子和2个内含子。推导的OrNAC5氨基酸序列具有典型的NAC类转录因子结构特征，与水稻（Oryza sativa）、短花药野生稻（Oryza brachyantha）、大麦（Hordeum vulgare）、谷子（Setaria italica）中相应蛋白的同源性分别为99%、81%、60%和58%。对OrNAC5启动子序列进行分析，结果发现存在多种激素应答和胁迫响应的调控元件。Real-Time PCR结果显示，低温、干旱和盐胁迫均能诱导OrNAC5的表达。上述结果表明OrNAC5可能在逆境响应过程中具有重要功能。

关键词 普通野生稻；OrNAC5；逆境；基因表达

中图分类号 S511.9 文献标识码 A

Abstract Bast on EST sequences， a gene named OrNAC5 conding NAC（NAM， ATAF and CUC）transcription factor was cloned from wild rice（Oryza rufipogon）in Hainan. The cDNA length was 699 bp and DNA length was 2 538 bp， containing three exons and two introns. The deduced OrNAC5 had the typical structure of NAC transcription factor， and showed high identities of 99%， 81%， 60% and 58% to those of NAC transcription factors from Oryza sativa， Oryza brachyantha， Hordeum vulgare and Setaria italica. Elements related to stress signals and hormone were found in putative promoter region of OrNAC5. Real-Time PCR results showed that OrNAC5 was induced by drought， salt stress and low temperature stress. All these data suggest that OrNAC5 may play important roles in regulating stress response.

Key words Oryza rufipogon； OrNAC5； Stress； Gene expression

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.09.016

干旱、低温和高盐等非生物胁迫严重影响了农作物的生长发育和作物产量[1-2]。植物已在分子、细胞和系统水平上进化出了一套复杂的信号网络来感受并响应各种外界刺激，转录因子在这一过程中扮演重要的调控作用[3]。NAC转录因子是植物特有的一类转录因子，含有一个大约150个氨基酸组成的高度保守的NAC结构域，广泛参与植物的生长发育、激素调节和胁迫响应[3-4]。NAC转录因子在拟南芥（Arabidopsis thaliana）、水稻（Oryza sativa）、大豆（Glycine max）、小麦（Triticum aestivum）等[4-7]植物中广泛存在且数量众多，拟南芥含有110个成员，水稻中则多达140个，但植物中只有少部分NAC转录因子的功能得到鉴定。最近，越来越多的研究证实NAC转录因子在响应干旱、低温和高盐等非生物胁迫过程中具有重要功能[8-10]。

普通野生稻（Oryza rufipogon）是栽培稻的祖先，能够长期生长在各种恶劣的自然条件下，具有很强的抗逆特性，是水稻抗逆育种重要的遗传资源[11]。海南普通野生稻最原始，遗传多样性最高，具有很高的开发利用价值[12-13]。在先前的研究中，筛选获得一批抗逆性较强的海南普通野生稻材料，能够长期在干旱、低温和贫瘠等条件下健康生长。为了进一步了解海南普通野生稻的抗旱机理，笔者对干旱条件下差异表达基因进行了分析，并筛选获得了1条与水稻中NAC转录因子基因ONAC005（GenBank登录号AK104766）同源性有99%的基因片段。本文在此基础上对该基因进行克隆和表达分析，为揭示该基因在胁迫响应中的功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

将在海南省农业科学院野生稻异位保存圃中收集的普通野生稻（Oryza rufipogon）种子，置于50 ℃烘箱中干燥48 h，打破休眠，用1%的HgCl2消毒10 min，清水冲洗4～5次。置于28 ℃人工气候箱培养（8 h光照/16 h黑暗），使用国际水稻所营养液[14]进行培养，每5 d换1次培养液，长至3叶期时于含有20% PEG的营养液中进行模拟干旱处理，含有150 mmol/L NaCl的营养液中进行盐胁迫处理，4 ℃光照培养箱中（8 h光照/16 h黑暗）低温处理，分别在处理0、2、4、6、12、24、48 h取样，用液氮磨成干粉状，-70 ℃保存备用。

1.2 方法

1.2.1 核酸提取及cDNA合成 普通野生稻叶片总RNA和基因组DNA的提取分别采用成都福际生物技术有限公司的植物总RNA提取试剂盒（RE-05011）和植物DNA提取试剂盒（DE-06111）进行，具体参见说明书。cDNA第一条链合成采用北京全式金生物技术有限公司反转录试剂盒（AT301-02），具体步骤参见说明书。

1.2.2 OrNAC5基因和启动子的克隆 根据先前筛选获得的NAC转录因子基因片段，在NCBI数据库中搜索到与它最相似基因的cDNA序列，设计特异引物OsNAC1F：5′-TTGATACGATGGAGAGGG

CGGC-3′和OsNAC1R：5′-GATCGGTTTAATTAGTC

TGTT-3′。根据OrNAC5在水稻基因组中最相似基因的启动子序列设计特异性引物PNAC1F：5′-CAG

ACAGATTGGCGAACCGGA-3′和PNAC1R：5′-GAA

GTACTTGTCCCCGTCGCT-3′，分别以海南普通野生稻cDNA和基因组DNA为模板，对OrNAC5的cDNA序列和启动子序列进行扩增。PCR扩增反应：94 ℃预变性3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35个循环；最后72 ℃延伸5 min。PCR产物经回收和纯化后，与pMD-18T Cloning Kit（TAKARA公司）连接。将连接产物转至DH5a感受态细胞，通过PCR检测确定阳性克隆，送北京诺赛基因组研究中心有限公司测序。

1.2.3 OrNAC5生物学信息学分析 用ORF finder分析OrNAC5 cDNA序列的开放阅读框，蛋白质序列分析在http：//www.expasy.org网站相关软件完成；利用在线软件GSDS对基因的外显子/内含子进行界定；通过BLAST（网址：http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）与GenBank中登记的序列进行同源性比较，用DNAMAN软件对氨基酸序列进行比对，并构建系统发育树；利用启动子顺式作用元件预测网站PLACE软件（http：//www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalscan. html）对OrNAC5启动子序列进行分析。

1.2.4 OrNAC5的表达分析 采用康为世纪公司的SYBR Green RT-PCR One Step Kit及Mx3005P PCR仪进行PCR产物实时荧光检测基因表达水平。目的基因引物为QNAC1F：5′-GGGTCATGCACGAGT

ACAG-3′和QNAC1R：5′-GCTGCTGCTCCTCTGAA

ATA-3′；内参引物为18S，其引物为18SF：5′-CG

TCCCTGCCCTTTGTACAC-3′和18SR：5′-CGAACA

CTTCACCGGATCATT-3′。PCR程序：95 ℃预变性 30 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40个循环。按默认程序绘制55 ℃至95 ℃融解曲线，并把 0 h的样品设为Calibrator，进行相对表达定量分析。

2 结果与分析

2.1 OrNAC5基因克隆和分子特征

先前的研究中，在海南普通野生稻中获得一条编码NAC转录因子的EST序列，本研究在此基础上对其编码区cDNA序列和基因组序列进行了克隆，将获得的基因命名为OrNAC5（GenBank登录号KJ690249）。OrNAC5编码区cDNA长度为699 bp，对应的DNA长度为2 538 bp，编码232个氨基酸。编码蛋白的分子量为24.70 ku，理论等电点为9.87。利用在线软件GSDS，对OrNAC5的基因cDNA和DNA序列进行比较分析发现，OrNAC5的基因组包含3个外显子和2个内含子（图1），外显子和内含子的剪接均符合GT-AG原则。

生物信息学分析结果表明，OrNAC5具有典型的植物NAC类转录因子结构特征，包含一个由138个氨基酸组成的NAC保守结构域（图2）。OrNAC5与水稻ONAC005（BAG96939）同源性为99%，涉及3个氨基酸的变异；与短花药野生稻（Oryza brachyantha，XP_006659635）、大麦（Hordeum vulgare，CBZ41165）、谷子（Setaria italica XP_004974022）中相应蛋白的同源性分别为81%、60%和58%。

2.2 OrNAC5启动子的克隆和序列分析

通过PCR扩增和序列比对，获得OrNAC5翻译起始密码子ATG上游1 341 bp的启动子序列，该序列和ONAC005相对应启动子区的同源性为97%（图3）。对OrNAC5启动子序列进行预测分析，发现该序列具有真核生物典型启动子结构特征，含有多个真核生物启动子基本元件，如启动子核心元件 TATA-box，增强子元件CAAT-box和GATA-box等；核心启动子区位于ATG上游-227～ -184 bp，其可能的转录起始位点位于翻译起始位点上游-193 bp处；OrNAC5启动子区还含有众多应答激素和胁迫信号元件，如茉莉酸应答元件CGTCA-motif、生长素应答元件TGA-element、赤霉素应答元件P-box和GARE-motif、厌氧应答元件ARE、高温应答元件HSE、干旱应答元件MBS以及防御和胁迫响应元件TC-rich repeats等；此外，还含有与分裂组织表达相关元件CAT-box、胚乳表达相关元件Skn-1_motif和幼苗特异表达元件as-2-box 等。这说明OrNAC5可能广泛参与生长发育、激素应答和胁迫响应等过程。

2.3 OrNAC5的表达分析

荧光定量PCR结果显示，PEG模拟干旱、盐和低温处理均能显著上调OrNAC5的表达。PEG处理后，OrNAC5的表达量在24 h 达到最大值（图4-A）；OrNAC5的表达在盐处理后早期变化并不明显，直到48 h后显著增加达到最大值（图4-B）；OrNAC5对低温比较敏感，处理后2 h OrNAC5的表达量显著上调，6 h时达到最大值，48 h时仍维持较高水平（图4-C）。

3 讨论与结论

大量研究证实NAC转录因子在植物响应生物和非生物胁迫过程中发挥重要作用[8-10]。例如，在拟南芥中AtNAC019、AtNAC055和AtNAC072能够激活下游盐和干旱胁迫基因的表达来增强植株抗旱性[15]；AtNAC2参与多种激素和盐胁迫响应，并与侧根的发育有关[16]；ATAF1和ATAF2在干旱和病菌响应过程中具有重要作用[17]。在棉花中6个NAC转录因子基因被克隆鉴定，它们的表达受到干旱、高盐、冷害等多种非生物胁迫的诱导。在水稻中也有多个NAC转录因子功能得到鉴定，通过表达OsNAC1、OsNAC5、OsNAC6、OsNAC045、OsNAC052和OsNAC063基因后能够增强植株对干旱和多种非生物胁迫的耐受性[18-24]。虽然大量的NAC基因在不同植物中得到克隆，但只有小部分基因的功能得到鉴定。

海南普通野生稻能够长期在干旱、低温和贫瘠等条件下健康生长，具有较强的抗逆性。本研究在海南普通野生稻中筛选获得一个受干旱诱导表达的NAC转录因子OrNAC5，该基因编码的蛋白有232个氨基酸组成，初步确定该基因是一个多逆境应答基因。OrNAC5除了受到干旱的诱导外，也能对低温和盐胁迫做出响应。植物基因启动子含有多种重要的顺式作用元件，在转录水平上通过与转录因子的协调作用，参与调控下游基因的表达，从而使植物能够对各种生物和非生物胁迫做出响应[25]。OrNAC5启动子区含有厌氧应答元件ARE、高温应答元件HSE、干旱应答元件MBS以及防御和胁迫响应元件TC-rich repeats等生物和非生物胁迫元件。进一步说明OrNAC5在野生稻的逆境胁迫响应中扮演重要角色。

普通野生稻驯化成栽培稻的过程中，一些基因会发生变异甚至丢失，这可能是普通野生稻具有更强的抗逆性的原因。OrNAC5在栽培稻中的同源基因ONAC005是一个功能未知基因，OrNAC5和ONAC005的编码蛋白有3个氨基酸的差异，更大的差异在于启动子区域，所以有必要对OrNAC5的功能进行继续研究，下一步将构建该基因的植物表达载体，通过转化水稻和拟南芥植物对其功能做进一步验证。

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