吴晓慧等

摘 要 转化酶抑制子调控转化酶的活性，在植物的糖代谢过程中具有重要作用。为了研究木薯的转化酶抑制子，本实验利用木薯基因组数据库分析及RT-PCR方法，从木薯中分离了1个木薯转化酶抑制子MeINH3的cDNA序列。MeINH3序列长度为564 bp，包含 528 bp的完整开放阅读框，编码127个氨基酸，N端有16个氨基酸残基的信号肽，4个保守的半胱氨酸残基可形成两个二硫桥。亚细胞定位预测表明，MeINH3蛋白定位于胞外。根据生物信息学分析结果，推测其可能抑制木薯细胞壁转化酶活性。

关键词 木薯；转化酶抑制子；基因克隆；生物信息学分析

中图分类号 S533；Q78 文献标识码 A

Abstract Invertase inhibitor controls the activity of invertase and plays a significant role in the sucrose metabolic processes in plants. An invertase inhibitor gene MeINH3 was isolated from cassava by cassava genome database analysis and RT-PCR. Analysis of the sequence indicated that the cDNA of MeINH3 was consisted of 564 bp with an open reading frame（ORF）of 528 bp encoding 127 amino acids. MeINH3 had a signal peptide including 16 amino acids at N terminus and four conserved cysteine residues forming two disulfide bridges. The subcellular localization prediction showed that MeINH3 protein was located extracellularly， suggesting that it may inhibit the activity of cassava cell wall invertase.

Key words Cassava； Invertase inhibitor； Gene cloning； Bioinformatics analysis

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.09.010

木薯（Manihot esculenta Crantz）是一种富含淀粉的块根作物，原产南美洲亚马逊河盆地，是热带亚热带地区重要的粮食与经济作物之一[1]。木薯淀粉的合成及积累是由植物体内一系列相关酶催化下完成的[2]。研究木薯淀粉合成过程中蔗糖代谢相关酶的活性变化，对高淀粉木薯新品种的选育具有非常重要的意义。在木薯叶片光合作用形成的蔗糖，经过韧皮部运输、卸载进入木薯块根，转化酶在这一生理过程中起着非常重要的作用[2-3]。转化酶（Iinvertase）在植物体内催化蔗糖分解成葡萄糖和果糖[4]，根据等电点、酶活的最适pH值、可溶性和亚细胞定位，可将转化酶区分为三类：液泡转化酶（Inv-V）、细胞壁转化酶（Inv-CW）和中性/碱性转化酶（Inv-N）[5]。转化酶参与了植物的韧皮部卸载[6]、抵御病原菌侵染[7]、逆境胁迫反应[8]、器官的形态建成[9]等生理过程。转化酶活性的调节包括转录调节和翻译后调节[10]。转化酶抑制子（invertase inhibitors，INH）与转化酶特异结合，抑制转化酶活性，属于翻译后调节[10]。转化酶抑制子基因由多基因家族编码，拟南芥基因组中有40多个与转化酶抑制子基因同源的序列[11]。转化酶抑制子调节木薯转化酶的活性，间接调节了碳水化合物的分配，因此研究木薯转化酶抑制子有助于阐明木薯淀粉积累机制。

1961年Schwimmer等[12]在研究马铃薯转化酶的酶学特性时发现了INH的存在。1998年Greiner等[13]首次从烟草悬浮细胞中克隆获得INH的基因序列，其重组蛋白可以抑制转化酶活性。成善汉[14]在马铃薯块茎中表达烟草液泡转化酶抑制子基因Ntinhh抑制了马铃薯液泡转化酶的活性，最终降低马铃薯还原糖的含量。这表明通过调节INH的表达，控制转化酶的活性，导致植物体内蔗糖代谢的改变。目前已有两个木薯转化酶抑制子基因MeINH1和MeINH2被克隆[15]，本实验克隆了木薯转化酶抑制子基因MeINH3，并进行生物信息学分析，为进一步研究木薯转化酶抑制子功能及其调控机制奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试材料 以中国热带农业科学院培育的SC8木薯叶片为实验材料，种植于海南大学农学院试验基地，植后90 d采样。

1.1.2 主要试剂 RNAplant plus Reagent植物总RNA提取试剂购自天根生化科技有限公司，TaKaRa RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0和DL 2 000 DNA Marker购自TaKaRa公司，DNA片段回收试剂盒和卡那霉素购自上海生工生物工程技术服务有限公司，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成；pEASY-T1 Cloning Kit 购自北京全式金生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 木薯叶片总RNA提取及反转录 采用RNAplant plus Reagent植物总RNA提取试剂提取SC8木薯叶片总RNA，具体操作参照产品说明书；总RNA经电泳检测后，采用TaKaRa RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0进行cDNA第一链的合成，具体步骤参照试剂盒提供的操作方案进行。

1.2.2 木薯转化酶抑制子基因的PCR扩增及序列分析 根据美国木薯基因组数据库（http：//www.phytozome.net/cassava）预测到一个木薯转化酶抑制子基因，设计特异引物扩增MeINH3基因。

上游引物：5′-GCAGCTAGTGGTCATGGGAAA

GG-3′

下游引物：5′-GCTAACTCGAAATTGGGTATGT

GAAA-3′

以SC8木薯叶片的cDNA为模板，扩增MeINH3基因，反应体系为：TaKaRa Ex Taq（5 U/μL）0.25 μL，10×Ex Taq Buffer（Mg2+ Plus）5 μL，dNTPs Mixture（各2.5 mmol/L）4 μL，10 μmol/L上下游引物各2 μL，cDNA模板1 μL，加水补足至50 μL。PCR反应条件为：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30循环；最后72 ℃延伸10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，用DNA片段回收试剂盒回收目的片段，连接pEASY-T1载体，转化DH5α感受态细胞，并涂布于含卡那霉素（100 μg/mL）的LB固体培养基，37 ℃过夜培养。挑取菌斑到含卡那霉素（100 μg/mL）的1.5 mL液体LB培养基，37 ℃振荡培养（200 r/min）8 h，菌液PCR鉴定阳性克隆送上海英俊生物技术有限公司测序。采用DNAMAN 6.0软件进行序列分析及同源树构建；采用在线软件对木薯转化酶进行亚细胞定位预测（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）及信号肽分析（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）。

1.2.3 MeINH3的蛋白质3D结构预测 利 用 Swiss-Model服务器（http：//swissmodel.expasy.org）对木薯转化酶抑制子MeINH3蛋白质3D结构的进行同源建模。模板为烟草细胞壁转化酶（PDB： 2cj8）。采用Pymol 软件显示和分析木薯转化酶抑制子MeINH3的3D结构。

2 结果与分析

2.1 木薯叶片总RNA提取及MeINH3的RT-PCR扩增

木薯叶片总RNA经1%琼脂糖凝胶电泳显示，28S rRNA和18S rRNA条带清晰完整，没有降解，质量较好，可用于后续的基因克隆实验（图1）。以反转录合成的cDNA第一链为模板，利用基因特异引物进行PCR扩增获得1条大小约600 bp的片段（图2）。

2.2 MeINH3的生物信息学分析

RT-PCR扩增片段测序结果表明，以特异引物扩增获得了一段564 bp的cDNA序列，其中包含一段528 bp的开放阅读框，编码127个氨基酸残基的蛋白质，推断的分子质量为18.91 ku。MeINH3编码的氨基酸序列与本实验室已克隆的两个转化酶抑制子（MeINH1和MeINH2）的氨基酸序列比对发现，它们氨基酸相似性在36%～61%之间，并且都具有4个保守的半胱氨酸残基位点，第一个残基和第二个残基可形成一个二硫桥，第三个残基和第四个残基形成另一个二硫桥，这两个二硫桥的存在，对MeINH的功能形成是必要的（图3）。利用在线软件Swiss-Model serve（http：//swissmodel.expasy.org）进行MeINH3的蛋白质3D结构预测。结果表明，MeINH3由5个β螺旋（N端两个β螺旋较小，C端β螺旋较大）和无规则卷曲构成，4个半胱氨酸残基可形成两个二硫桥（Cys31与Cys40，Cys99与Cys140）（图4）。

3个木薯转化酶抑制子在N端都含有一段信号肽，MeINH1和MeINH2的信号肽分裂位点位于VQS和DAN之间，MeINH3的信号肽长度为16个氨基酸残基，分裂位点位于VHA和AIP之间（图3、5）。亚细胞定位预测表明，MeINH3定位于细胞外，预测得分为0.772（表1）。

木薯（Manihot esculenta Crantz）、马铃薯（Solanum tuberosum）、咖啡（Coffea canephora）、烟草（Nicotiana tabacum）、香瓜（Cucumis melo）、玉米（Zea mays）、拟南芥（Arabidopsis thaliana）、葡萄（Vitis vinifera）、番茄（Solanum lycopersicum）和野草莓（Fragaria vesca）转化酶抑制子的氨基酸序列比对及蛋白的系统树分析结果表明，不同的基因编码的INH同源性较低（图6），相似性在12.7%～61%之间。MeINH1和MeINH2在一个进化分支上，与拟南芥的AtCVIF1亲缘关系最近，氨基酸序列相似性分别为40.1%和42.6%；MeINH3在另一进化分支，与玉米的ZmINH亲缘关系最近，氨基酸序列相似性为17.14%。

3 讨论与结论

本实验克隆获得的MeINH3的蛋白质分子质量为18.91 ku，这一结果与植物INH蛋白分子质量（16～20 ku）相符[16]。有研究结果表明，植物INH蛋白的4个保守半胱氨酸残基可分别形成两个二硫桥，使蛋白结构稳定并具有活性[10]。本实验室获得的3个木薯INH基因编码的蛋白质中都具有4个保守的半胱氨酸残基。MeINH3的蛋白质3D结构建模预测分析发现，Cys31与Cys40，Cys99与Cys140可分别形成两个二硫桥。这表明，二硫桥对MeINH3的蛋白结构的稳定具有重要作用。植物INH蛋白的N端均具有一段信号肽序列，以利于蛋白质的运输[10]。木薯的3个INH蛋白（MeINH1-3）的N端同样具有一段信号肽序列，其中MeINH3的信号肽最短（16个氨基酸残基），分裂位点位于VHA和AIP之间。系统树分析结果表明，MeINH3与MeINH1、MeINH2的亲缘关系较远，与玉米的ZmINH亲缘关系最近。亚细胞定位预测结果表明，MeINH3定位于细胞外。根据以上生物信息学分析结构，可推测MeINH3可调控细胞壁转化酶的活性。

INH是多基因编码的蛋白，家族成员的序列保守性较差[17]，对3个木薯INH氨基酸序列比对及与其他物种的进化树分析也证明了家族成员的序列保守性较差（氨基酸相似性在36%～61%之间）。INH与果胶甲酯酶抑制子PMEI的序列较为相似，INH或PMEIs同源的基因都称为果胶甲酯酶相关蛋白序列（PMEI-RPs）[12]。只通过序列分析还无法区分INH和PMEI[10]，所以克隆获得的3个序列（MeINH1-3）还需要进一步实验，表达重组蛋白验证MeINH1-3是否真正抑制木薯转化酶活性。本研究对木薯转化酶抑制子基因MeINH3进行了克隆及行生物信息学分析，为进一步研究木薯转化酶抑制子功能及其调控机制奠定了基础。

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