郭琳　钟金城　柴志欣等

摘要：为探讨脑红蛋白（NGB）在西藏牦牛高原低氧适应机制中的作用，利用分子克隆技术获得了西藏牦牛NGB基因序列，并采用生物信息学方法对该基因及其编码蛋白质的理化性质、疏水性、二级结构等进行了预测分析。结果发现，NGB基因全长为2 993 bp，编码125个氨基酸；其编码蛋白属于亲水性蛋白，二级结构主要以α螺旋为主。系统进化树分析表明，西藏牦牛NGB与野牦牛、牛、绵羊等物种的遗传距离较近，具有高度同源性。

关键词：西藏牦牛；NGB基因；克隆；生物信息学分析

中图分类号： S823.8+52文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）11-0026-04

收稿日期：2015-04-27

基金项目：西南民族大学研究生创新型科研项目（编号：CX2015SZ106）；西南民族大学研究生学位点建设项目（编号：2014XWD-S071007）。

作者简介：郭琳（1990—），女，山东菏泽人，硕士研究生，主要从事分子生态学研究。E-mail：guolin20151@163.com。

通信作者：陈智华，博士，教授，主要从事生物多样性研究。E-mail：Chenzhihua_czh@sohu.com。牦牛（Bos grunniens）属哺乳纲偶蹄目反刍亚目牛科长毛的牛属动物。主要生活在高寒生态条件下海拔3 000m以上的地区，是青藏高原特有的牛种，被认为是研究高原低氧适应的代表性动物之一[1]。该物种主要分布于喜马拉雅山、阿尔金山、昆仑山以及祁连山，这些地区海拔高、地势复杂、空气稀薄、气候寒冷，年平均气温在0 ℃以下，最低温度可达 -50 ℃，环境极端恶劣复杂。西藏自治区是我国牦牛的主产区之一，由于各地区自然生态环境条件的差异，形成了桑桑牦牛、丁青牦牛、桑日牦牛、类乌齐牦牛、工布江达牦牛、申扎牦牛、巴青牦牛等不同的地方品种和类群，其中类乌齐牦牛[2]主要分布于西藏自治区昌都市类乌齐县，对于高海拔、含氧量低的高寒地区有着良好的适应性。目前对脑红蛋白（neuroglobin，NGB）基因的研究主要集中在人、小鼠、猪以及甘南牦牛[3-6]，而对西藏牦牛NGB基因的研究尚未见报道。本研究通过对类乌齐牦牛NGB基因的全序列克隆与表达，为进一步研究牦牛高原低氧环境的适应性机制奠定基础。脑红蛋白是近期发现的一种携氧球蛋白，是继血红蛋白（hemoglobin，HB）和肌红蛋白（myoglobin，MB）之后的第3种携氧球蛋白，主要在脊椎动物神经组织和视网膜中表达[7]。Burmester等最初利用斑点杂交法在小鼠大脑前叶、下丘脑和丘脑中发现NGB mRNA的分布，并通过原位杂交法发现海马的锥体细胞层有NGB mRNA阳性物质的存在[8]。2001年，我国学者张成岗等对大鼠脑红蛋白基因编码区进行了克隆及多态性分析，证明了其多个多态位点的存在，并进一步验证了NGB基因在大鼠脑供氧及氧结合与运输中的重要作用[9]。马兰等对青藏高原特有物种藏羚羊的NGB基因进行了研究，着重分析了该基因在不同组织表达分布情况，发现NGB mRNA在大脑皮层顶叶中的表达最高，继而是海马、尾状核等，证实了NGB基因与藏羚羊对低氧环境有极强的适应性有关[10]。脑红蛋白的主要功能是与循环中的O2结合，形成氧合NGB，在脑组织缺氧或神经元耗氧突然增加时把储存的O2释放，以提供组织对氧的需要[11]。但目前低氧引起脑红蛋白增加的机制尚不十分清楚，本研究通过对高原牦牛NGB基因的研究，探究其表达变化模式与西藏牦牛低氧适应性的关系。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1试剂大肠杆菌E. Coli DH5α购于TIANGEN公司；pMDl9-T克隆载体购于TaKaRa公司；DNA提取试剂盒和凝胶回收试剂盒为Axygen公司产品；胰蛋白胨、琼脂粉、酵母浸出粉均购于Oxoid公司，琼脂糖为成都科龙化工试剂厂产品。梯度PCR仪为Eppendorf（Germany）。

1.1.2样品牦牛耳组织样品，采自于西藏自治区类乌齐县的类乌齐牦牛。液氮保存带回实验室，-80 ℃保存备用。

1.2方法

1.2.1基因组DNA提取利用组织基因组DNA提取试剂盒（TIANGEN）提取基因组DNA[12]，采用1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度，使用DNA marker D2000（TIANGEN）。

1.2.2引物设计与合成参考NCBI数据库GenBank中野牦牛（NW_005398357）NGB基因序列，采用交叉重叠原理，用Primer Premier 6.0软件设计2对引物（表1）对NGB基因序列进行PCR扩增获得西藏NGB基因的序列。引物由上海伯津生物技术有限公司合成。

1.2.3NGB基因的克隆PCR 产物经10 g/L 琼脂糖凝胶电泳检测并观察扩增结果，用Axygen的凝胶回收试剂盒回收纯化PCR 产物，取适量纯化后的PCR 产物与克隆载体pMD19-T 进行连接，转化DH5α 感受态细胞并在Amp的琼脂平板上涂菌，37 ℃培养12 h。在固体LB培养基上挑取单个菌落连接于含Amp的LB液体培养基中[13]。经PCR检测鉴定后，将阳性重组质粒送往上海伯津生物技术有限公司测序，使用软件剪切拼接后获得全长序列。

1.2.4NGB基因序列分析将序列扩增结果进行拼接，运用Protparam 和ProtScale等在线分析软件对NGB基因的理化性质及亲水性/疏水性进行分析预测。运用TMpred预测蛋白质跨膜区结构。运用在线分析软件NetPhos 2.0 Server进行磷酸化位点分析。用MegAlign和MEGA.5 软件，对类乌齐牦牛NGB基因与NCBI中获得的17个物种的NGB基因序列进行同源性比较，并构建系统发育树。运用在线软件CpGplot预测分析，预测NGB基因中是否含有CpG岛。

2结果

2.1NGB基因的扩增

扩增产物经10 g/L 琼脂糖凝胶电泳检测，可见NGB-1扩增为大于2 000 bp片段，与预期的2 035 bp片段长度较一致。NGB-2扩增结果在1 000～2 000 bp之间，靠近1 000 bp，与预期扩增的1 200 bp片段长度基本一致（图1），初步证明克隆成功。

2.2NGB基因序列分析

运用GENSCAN 1.0（http：//genscanw.biosino.org）对克隆得到的类乌齐NGB基因进行在线预测分析，发现类乌齐牦牛NGB基因预测开放阅读框长度为378 bp，共编码125个氨基酸，起始密码子为ATG，终止密码子为TAA（图2）。运用在线软件CpGplot预测分析，未发现NGB基因中含有CpG岛。

2.3密码子分析

密码子是核酸和蛋白质携带遗传信息的基本原则，是生物体内信息传递的基本环节。基因密码子的使用和基因编码的蛋白结构功能密切相关。运用CodonW软件对NGB基因进行密码子使用偏好性分析。密码子适应指数（codon adaption index，CAI）为0.306，代表了密码子与高表达基因的所用密码子的接近程度。有效密码子数（effective number of codon，NC）为30.06，代表密码子的偏好程度。通常，CAI与NC成正相关。GC含量为0.643，密码子第3个碱基中GC出现的频率（GC3s）为0.866，不同物种中GC含量具有很大的变化，CAI和NC影响着密码子的选择。密码子偏爱指数（cond bias index，CBI）为0.251，最优密码子使用频率（frequency of optimal condons，FOP）为0.555，同义密码子数（L_sym）为119，总平均亲水性（grand average of hydropathy，GRAVY）为-0.015 200，证明此蛋白为亲水性蛋白（表2）。

2.4NGB基因编码蛋白理化性质分析

运用ProtParam（ http：//web.expasy.org/protparam ）在线软件对NGB基因编码蛋白理化性质进行预测，分析结果显示该蛋白质分子质量为13 901.9 u，由20种氨基酸组成，最高含量为Leu（14.4%）。带负电荷的残基总数（Asp+Glu）为15个，带正电荷的残基总数（Arg+Lys）为12个。该蛋白的不稳定系数为51.56，表明此蛋白具有不稳定性[14]。

2.5蛋白质结构功能预测

2.5.1NGB基因编码蛋白质亲水性/疏水性分析运用ProScale程序（ http：//expasy.org/tools/protscale.html ）对NGB基因进行亲疏水性分析，正值越大说明越疏水，负值越大说明越亲水[15]。最小值为-1.433，分别位于第22、23和24氨基酸上，亲水性最强。最大值为2.544，位于第46位氨基酸，疏水性最强（图3）。由于亲水性所占比例大于疏水性，由此推断该编码蛋白表现为亲水性，亲水蛋白起调控作用，稳定性较差，与上述理化性质分析结果相一致。

2.5.2NGB基因跨膜区结构预测跨膜区域即蛋白在细胞膜内的部分，跨膜区域数量不限，有的1个，有的可能存在多个跨膜区域。运用TMpred（http：//www.ch.embnet.org/softweare/TMPRED_form.html）预测蛋白质跨膜区和跨膜方向，其中在第17～33位氨基酸区域可能存在TM-螺旋（图4）。

2.5.3蛋白质磷酸位点分析运用分析软件NetPhos2.0 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/），对NGB基因磷酸化位点进行在线分析，发现该基因编码蛋白共含有8个磷酸化位点，其中Ser磷酸化位点6个，分别位于第24、25、32、57、58、81碱基处；Thr磷酸化位点2个，位于51和82位碱基处；不含有Tyr磷酸化位点（图5）。

2.5.4蛋白质的保守结构域运用NCBI中[Conserved Domain Search Service （CD Search）]在线分析NGB基因的蛋白质保守结构域，有1个保守功能结构域，是1个珠球蛋白。超级珠蛋白家族中包含了各种各样的螺旋蛋白结合的卟啉、藻胆蛋白和其他非血红素辅助因子（图6）。

2.5.5NGB基因编码蛋白质功能分析运用分析软件Protfun2.2 Server（www.cds.dtu.dk/services/ProtFun-2.2）对NGB基因编码蛋白质进行功能分析。蛋白质功能以运输和结合为主，概率为0.773，可能性是1.885。其次是嘌呤嘧啶和辅因子的生物合成，概率分别是0.331和0.210（表3）。由此推断此蛋白属于运输蛋白，可以有效地与氧结合，促进氧在脑中的转运，从而提高氧的利用率。

2.6西藏牦牛NGB的系统进化分析

用MegAlign和MEGA.5 软件，将获得的18条NGB基因序列构建系统发育树[16]（图7），类乌齐牦牛与牦牛和牛的亲缘关系最近，具有高度的同源性。并与绵羊、长江豚、猪、猕猴、橄榄狒狒、黑猩猩、人、长臂猿、天竺鼠、狗、蝙蝠、兔子、老鼠、中国仓鼠形成哺乳动物的一个分支，与鸡形成一个较远的分支。

3讨论

低氧适应性一直是高原生态研究的重点，而牦牛又是高原低氧地区特有的物种之一，对高原地区特有的生态环境具有极强的适应力。因此，本研究选用西藏牦牛作为研究对象，通过对类乌齐牦牛NGB基因的研究，进一步分析牦牛对低氧适应性的影响。脑红蛋白、肌红蛋白、血红蛋白为3大携氧球蛋白[17]，其中脑红蛋白作为一种内源性神经蛋白，参与了神经元氧分的运输和储存[18-19]。虽然在脑蛋白中含量很低，仅为0.01%，但有利于提高氧的利用率，在缺氧条件下具有很显著的神经保护作用[20-21]。2000年，Burmester等[8]研究证实该蛋白主要在脑中表达，可能会增加脑组织的氧供应。在对西藏牦牛NGB基因的组织表达研究中发现该基因表达主要存在于神经细胞中，同时也有研究发现存在于哺乳动物消化器官中。Sun等[22]对NGB基因的药物机理进行了研究分析，发现该基因在缺氧环境下能保护神经细胞，识别缺氧环境，在缺氧环境下NGB基因的表达量将会升高。

本研究克隆了类乌齐牦牛NGB基因，并进行了生物信息学分析。研究发现，类乌齐牦牛NGB基因开放阅读框长度为378 bp，编码125个氨基酸。该蛋白的不稳定系数为51.56，表明该蛋白具有不稳定性。石宁宁等[4]对甘南牦牛的研究也证明了该基因具有不稳定性，极易与氧结合，亲水性所占比例大于疏水性，为水溶性蛋白，能够有效地在缺氧条件下，运输和储存氧分来满足机体需求，与在蛋白质功能预测中结果一致，编码蛋白功能主要为运输和结合为主，进一步证实了NGB基因在氧运输中的作用，白振忠等[23]在对高原鼠兔脑红蛋白基因研究中也得到了类似结论。在第17～33位氨基酸区域可能存在TM-螺旋，有1个保守功能结构域。与普通牛进行对比，缺失了26个氨基酸，与野牦牛对比具有高度同源性，是否存在突变或由于类乌齐地区特殊的生态环境造成，需进一步研究。超级珠蛋白家族中包含了各种各样的螺旋蛋白结合的卟啉、藻胆蛋白和其他非血红素辅助因子，并在3个领域中扮演着不同的角色，包括传感器或是氧气的运输。它包括M（肌红蛋白）、S（蛋白传感器）、T（截短蛋白，TrhB）家族和藻蛋白（PBPs）。M家族包括镶嵌和单结构域蛋白，S家族包括珠蛋白耦合传感器、单结构域蛋白，T家族分为3个主要群体TrHb1s （N）、TrHb2s （O）、TrHb3s （P）。M和S家族具有血红蛋白的一个典型的二级结构。在对类乌齐牦牛NGB基因的同源性研究中显示，野牦牛、牛和绵羊等物种与类乌齐牦牛具有高度同源性，系统进化树的构建与动物分类学的观点基本一致，这与李盛杰等对天竺白牦牛的研究结果[20]相一致，表明了NGB基因在生物进化上的高度保守性。

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