陈 永，林良才，肖冬光，田朝光*

（1.天津科技大学生物工程学院，天津 300457；2.中国科学院天津工业生物技术研究所系统微生物工程重点实验室，天津 300308）

里氏木霉（Trichoderma reesei）是生产纤维素酶的重要工业菌，具有良好的合成和分泌蛋白能力，已广泛应用于食品、饲料、纺织、制浆和造纸等行业用纤维素和半纤维素酶的生产[1-3]。里氏木霉RL-P37菌株是重要的工业菌株，1983年由Lehigh大学的学者[4]诱变获得，该菌除了比它的亲本株Rut NG14的酶活更高之外，更重要特性是可以在大约37 ℃生长良好，显著高于其他木霉（30 ℃）。这一特性使其在发酵过程中显著的降低能耗，达到降低生产成本的目的。此外，该菌对代谢物阻遏具有抗性，如它可以在玉米酿造酒精的过程中产酶，但不会被其他的代谢产物（甘油等）所阻遏[4]。有报道指出，在以5%纤维素（过滤渣BW200）为碳源，添加玉米浆为氮源的情况下发酵培养，其滤纸酶活（filter paper activity，FPA）（108 IU/h）甚至高于里氏木霉RUT-C30的FPA酶活（87 IU/h），是原始株QM6a的5～6倍[4]。因此，里氏木霉RL-P37是良好的纤维素酶生产和蛋白表达系统构建的出发菌株。

在里氏木霉遗传转化过程中，常用的抗性筛选标记有Hygromycin[5]、G418[6]、Bleomycin[7]等，但其数量有限，并且无法实现无痕操作。然而，营养缺陷型筛选标记可以克服上述的不足[8]。传统的方法是通过诱变筛选的方法获得amdS、niaD等营养缺陷型菌株，其缺点是在诱变的过程中引入了其他突变，不利于后续的分子改造和机理研究。本研究用同源重组法获得了里氏木霉RL-P37的尿嘧啶营养缺陷型菌株。该突变体具有潮霉素（hygromycin）和5-氟乳清酸（5-fluorine orotic acid，5-FOA）抗性，同时其在未添加尿苷（uridine）的基本培养基（minimal medium，MM）上不能生长。此外，利用来自于粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）的pyr4基因对突变体进行了回补，得到了回补菌株CY-1，其在不含尿苷（uridine）的MM培养基上与出发菌株RL-P37生长无显著差别。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌株和质粒

里氏木霉RL-P37：美国农业研究菌种保藏中心（NRRL-15709）；质粒pPK2（含有PgpdA启动子和TtrpC终止子的潮霉素序列）：美国真菌遗传保存中心（fungal genetics stock center，FGSC）；大肠杆菌转化用的Trans1-T1 Chemically Competent Cell：北京全式金公司；其他菌株和质粒均为本研究构建。

1.1.2 试剂和工具酶

用于原生质体制备的溶壁酶：美国Sigma公司；潮霉素（hygromycin）：美国Amresco公司；pJET1.2/blunt Cloning Vector和EcoRV、XhoI、T4 DNA Ligase等工具酶：美国Thermo scientific公司；pMD19-T Simple Vector载体：日本TakaRa公司；质粒提取、胶回收、DNA纯化试剂盒：康为世纪公司。

1.1.3 培养基

大肠杆菌培养用LB（Luria-Bertani）培养基：蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，氯化钠10 g/L；固体LB培养基在此基础上添加15 g/L的琼脂粉。

里氏木霉RL-P37生孢所用最小必需培养基（minimal essential medium，MEA）：麦芽提取物30 g/L，琼脂粉15 g/L。

原生质体转化再生底层培养基是在MEA培养基的基础上添加1 mol/L的山梨醇（sorbitol）182.17 g/L，121 ℃灭菌20 min。冷却至室温后添加2 mg/mL的已过滤尿苷（uridine）、100 μg/mL的潮霉素（hygromycin）；上层培养基是将底层培养基中的琼脂粉换成7 g/L的琼脂糖，其他不变。

里氏木霉MM[9]培养基：葡萄糖20 g/L，（NH4）2SO45 g/L，KH2PO415 g/L，MgSO4·7H2O 0.6 g/L，FeSO4·7H2O 5 mg/L，CaCl20.6 g/L，MnSO4·H2O 1.6 mg/L，ZnSO4·7H2O 1.4 mg/L，CoCl22 mg/L，用NaOH调节pH值至5.5，115 ℃灭菌30 min。固体培养基添加15 g/L的琼脂粉。

单胞分离培养基：在MM固体培养基的基础上添加0.1%的TritonX-100、2 mg/mL的尿苷（uridine）和100 μg/mL的潮霉素（hygromycin）。

1.2 仪器与设备

ZHWY-200B恒温振荡培养器：上海智诚分析仪器有限公司；DPX-916RB-1 37 ℃恒温培养箱：上海福玛实验设备公司；Master cycler gradient PCR仪、Concentrator plus 5305真空浓缩仪：德国Eppendorf公司；UV-1800紫外分光光度计：日本岛津公司；BX51荧光电子显微镜：奥林巴斯株式会社；D-63505 28 ℃恒温培养箱、NanoDrop 2000c核酸蛋白分析仪：美国Thermo Scientific公司；MiniBeadbea ter-16 21孔珠磨机：美国BIOSPEC公司；PB-10 pH计：赛多利斯（北京）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 里氏木霉的培养和基因组提取

将里氏木霉孢子接种到MEX 斜面上，28 ℃培养10 d。里氏木霉和粗糙脉孢菌基因组的提取参照常规的丝状真菌基因组的提取方法[10]。

1.3.2 PCR引物设计及载体构建

参照JEFFREY L等[11]的文献，查阅美国国家生物技术信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）上木霉pyr4基因和pPK2质粒的序列信息，运用Oligo7软件设计引物，本研究所用的引物序列见表1。

以pPK2质粒为模板，利用引物pGHT-F和pGHT-R扩增得到潮霉素抗性表达元件，将其连到pMD19-TSimpleVector上，得到pGHT载体，如图2（A）。以1.3.1中提取的木霉RL-P37基因组为模板，利用pyr4-UF、pyr4-UR和pyr4-LF、pyr4-LR分别扩增得到pyr4基因上下游同源臂（pyr45'-flank和pyr43'-flank）。将上游同源臂用EcoRV和NotI酶切，并插入pGHT相应的酶切位点间，得到pGHT-pyr4U。然后，用PacI和DraI酶切获得下游同源臂，将其插入pGHT-pyr4U的PacI和HpaI位点间，从而获得敲除质粒pGHT-Δpyr4。本研究中PCR片断均测序验证，不再赘述。

根据FORMENT J V等[12]的文献，从粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）数据库中查找粗糙脉孢菌的pyr4基因及其上下游序列，以1.3.1中提取的粗糙脉孢菌基因组为模板扩增得到pyr4的表达元件，并连入到T载体中，得到T-pyr4。用EcoRI 和EcoRV酶切pPK2SurGFP质粒[13]，获得绿色荧光蛋白表达元件，将其插入到T-pyr4的EcoRI、HpaI酶切位点之间，得到回补质粒pNcpyr4-GFP。

1.3.3 原生质体制备和转化

原生质体制备和转化参照PENTTILA M等[14]方法。转化完成后将转化液均匀涂布在含有100 μg/mL 潮霉素（hygromycin）、2 mg/mL尿苷（uridine）的再生培养基上，28 ℃培养3～4 d，直到出现可见的转化子，挑选潮霉素抗性转化子作进一步鉴定。回补转化时再生培养基不用添加尿苷（uridine）。

表1 PCR引物设计Table 1 Design of PCR primers

1.3.4 Southern杂交

参照王关林等[15]的方法进行标记，杂交和检测步骤按DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II，Roach说明书进行。

2 结果与分析

2.1 RL-P37 pyr4基因敲除实验设计

图1 RL-P37敲除pyr4基因敲除实验设计和重要片段获得Fig.1 pyr4 gene replacement design and obtain of the major fragments

敲除RL-P37pyr4基因流程如图1（A）所示。以RL-P37基因组DNA为模板，扩增木霉pyr4基因的上游、下游同源臂（pyr45'-flank、pyr43'-flank）片段，大小分别为1.5 kbp、1.4 kbp，如图1（B）所示；以pPK2质粒为模板，利用pGHT-F、pGHT-R扩增含有gpdA启动子和trpC终止子的潮霉素序列，大小为2.7 kbp，如图1（C）所示；以粗糙脉孢菌基因组DNA为模板，利用pyr4-F、pyr4-R扩增得到Ncpyr4序列，大小为3 kbp，如图1（D）所示。

2.2 敲除盒及回补质粒的构建

参照1.3.2的方法，用EcoRV和NotI酶切2.1中扩增出来的上游同源臂，将其插入pGHT相应的酶切位点之间，得到pGHT-pyr4U。然后用PacI和DraI酶切下游同源臂，将其插入pGHT-pyr4U的PacI和HpaI位点间，经测序正确得到敲除盒pGHT-Δpyr4，如图2（B）所示。以1.3.1中提取的粗糙脉孢菌基因组为模板扩增得到pyr4的表达元件，并连入到T载体中，得到T-pyr4。用EcoRI 和EcoRV酶切pPK2SurGFP质粒[13]，获得绿色荧光蛋白表达元件，将其插入到T-pyr4的EcoRI、HpaI酶切位点之间，得到回补质粒pNcpyr4-GFP，如图2（C）所示。

2.3 里氏木霉RL-P37 pyr4基因的敲除

将pGHT-Δpyr4敲除盒质粒通过原生质体法转化RL-P37，在含有尿苷（uridine）和潮霉素（hygromycin）的MEX培养基上，28 ℃培养3～4 d 后，可见转化子。挑选转化子至抗性平板上，在抗性平板上传代培养3次后进行了PCR验证，进一步通过单孢分离得到了阳性转化子，命名为RL-P37Δpyr4，结果如图3所示。

图3 RL-P37Δpyr4转化子的PCR电泳图Fig.3 PCR electrophoretogram of RL-P37Δpyr4 transformant

2.4 Southern杂交验证RL-P37Δpyr4突变体

图4 Δpyr4基因敲除突变体Southern杂交分析Fig.4 Southern analysis for the knockout of RL-P37 pyr4 gene

为了进一步验证所获得的突变株，进行了Sourthern杂交分析，以pyr4基因部分上游同源片段为探针，杂交结果如图4所示。由图4可知，在出发菌株基因组DNA中只有一条1.5 kbp左右的杂交带，说明pyr4在基因组上为单拷贝。由于用抗性基因hph的表达元件替换了出发菌株中的pyr4基因，因而在突变株RL-P37Δpyr4基因组DNA中仅得到一条3.5 kbp左右的杂交带，也证明了在敲除pyr4基因的同时没有发生随机插入。

2.5 RL-P37Δpyr4突变体的回补

图5 回补菌株的PCR电泳图Fig.5 PCR electrophoretogram of complement strains

为了验证得到的突变体的表型确是由缺失pyr4引起的，用来自粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）pyr4基因对得到的突变体进行了回补。pyr4基因在很多丝状真菌中有很高的保守性[16]，同时，利用外源基因将不会导致其在原位点整合，外源基因的功能也不会受影响。挑选16株回补转化子于木霉的MM固体培养基上，从中转接5株生长比较快的转化子到生孢培养基上，待孢子成熟后提取基因组，用Ncpyr4-F、Ncpyr4-R引物进行PCR验证，结果如图5所示。从图5可以看出，4～8泳道回补菌株条带大小与1泳道回补质粒的大小相同，而出发株（2泳道）和阴性对照（3泳道）并无目的条带，初步确认得到了回补菌株。

为了进一步确认回补菌株的表型，同时对其中的4号（现命名为CY-1）和P37Δpyr4进行了平板生长测试，结果如图6所示。由图6可知，在不加尿苷（uridine）的MM培养基上，出发菌RL-P37和回补菌株CY-1生长很好，P37Δpyr4不能生长。此外，为了考察以该营养缺陷型菌株为出发菌株表达外源蛋白的可行性，在回补质粒中引入了绿色荧光蛋白表达元件。结果显示，回补菌株CY-1的菌丝中可以观察到较强的绿色荧光（见图7），实现了外源蛋白的高效表达。

图6 P37,37Δpyr4,CY-1的MM平板生长实验Fig.6 MM plate growth experiment of P37,37Δpyr4,CY-1

图7 回补菌株CY-1的荧光照片Fig.7 Fluorescent photograph of complement strain CY-1

3 结论

近年来发展起来的DNA介导转化系统开启了探索以丝状真菌作为蛋白表达系统的研究方向[17]。自发现以后，由于受专利和技术等限制，利用分子生物学手段对高产菌RL-P37进行遗传改造的文献报道较少。随着其在欧洲和加拿大专利的到期[18]，采用分子生物学手段对其进行遗传改造以期获得能够用于基因敲除、外源蛋白表达的底盘菌显得尤为重要。为此，采用同源重组法成功敲除了里氏木霉高产菌RL-P37的pyr4基因，获得了纯核的、单拷贝插入的突变体，并成功对其进行了回补。该突变体可当做其他基因遗传操作的底盘菌。从该菌出发，可以构建纤维素酶产量进一步提高的工程菌或者实现外源蛋白的高效表达，具有十分重要的现实意义。

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