李馥邑 王文侠 徐伟丽 张慧君 张显斌

（齐齐哈尔大学食品与生物工程学院黑龙江省普通高校农产品加工重点实验室1，齐齐哈尔 161006）

（哈尔滨工业大学食品科学与工程学院2，哈尔滨 150090）

多糖是一类具有丰富结构多样性的特殊生物大分子，可通过生物途径普遍在有机体内合成，并参与细胞的各种生命活动，具有抗衰老、抗氧化、抗癌、抗诱变等生物活性。硫酸多糖是一类在糖链上带有硫酸基团的多糖，通过对天然硫酸多糖研究已证实其具有突出的抗病毒活性，而这与硫酸根的存在息息相关［1］。近年来，多糖硫酸化结构修饰在赋予或增强天然多糖的活性，降低某些药物的毒副作用等方面已取得一定的进展，包括抗病毒、抗凝血、抗肿瘤、调节免疫系统等功效［2］。

玉米作为我国主要的农作物之一，2012年其年产量高达2.08亿t，位居世界第二。玉米皮是玉米深加工的副产物，占玉米籽粒的15%，其主要成分为半纤维素、纤维素及木质素等，是良好的食用、药用植物活性多糖来源。但由于缺乏相应的基础理论研究，绝大多数用于饲料生产或废弃，并未得到充分利用，造成食物资源浪费。国内外已有研究表明玉米皮活性多糖有良好的物性及生物活性［3-5］，但目前未见有关玉米皮活性多糖结构修饰方面的研究报道。

本试验以碱性过氧化氢法提取的玉米皮多糖（APCP）为原料，对氯磺酸-吡啶法制备硫酸酯化玉米皮多糖（SAPCP）的工艺条件进行了优化，并研究了硫酸酯化玉米皮多糖清除羟基自由基的能力，以期了解多糖硫酸化修饰对玉米皮多糖抗氧化活性的影响，为玉米皮多糖及其衍生物的开发利用提供相关的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

玉米皮多糖（APCP），以脱脂玉米皮为原料，经除淀粉、蛋白质及水溶性多糖后采用碱性过氧化氢法提取，醇沉后冷冻干燥制得［6］。

1.2 仪器与设备

UV757CRT紫外分光光度计：上海精密科学仪器有限公司；RE-52AA旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；TDL-5-A型低速台式离心机：北京医用离心机厂；102041真空冷冻干燥机：CHRIST；HH-S1电热恒温水浴锅：上海跃进医疗仪器厂；DF-Ⅱ集热式磁力加热搅拌器：金坛市医疗仪器厂。

1.3 试验方法

1.3.1 硫酸酯化玉米皮多糖的制备

将带有冷凝管和搅拌装置的三颈瓶置于冰盐浴中冷却，加入预冷的无水吡啶，在剧烈搅拌状态下按照一定比例缓慢滴加氯磺酸，反应温度控制在室温以下，反应在30 min内完成，结束后得到淡黄色的酯化试剂。精确称取一定量玉米皮多糖，将其溶解于一定体积的 N，N-二甲基甲酰胺中，加入到配置好的酯化试剂中，在一定温度下搅拌反应一定时间，反应结束后，于冰浴中冷却，用 4 mol／L NaOH调pH至7，加入4倍体积无水乙醇后静置过夜，收集醇析后沉淀并将其用蒸馏水复溶，流水透析72 h，蒸馏水透析12 h，透析液真空浓缩后冷冻干燥，得SAPCP。

1.3.2 酯化试剂比例对SAPCP取代度的影响

按照1.3.1的方法，调节 V氯磺酸：V吡啶的比例为1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5，在酯化试剂与多糖溶液的体积比4∶3，反应温度70℃，反应时间2 h的条件下完成反应，测定不同酯化试剂比例下SAPCP的取代度。

1.3.3 酯化试剂与多糖溶液的体积比对SAPCP取代度的影响

按照 1.3.1的方法，调节 V酯化试剂：V多糖溶液的比例为 4∶1、4∶2、4∶3、4∶4、4∶5，在酯化试剂比 1∶3，反应温度70℃，反应时间2 h的条件下完成反应，测定不同酯化试剂与多糖溶液体积比例下SAPCP的取代度。

1.3.4 不同反应温度对SAPCP取代度的影响

按照1.3.1的方法，调节反应温度分别为40、50、60、70、80℃，在酯化试剂比1∶3，酯化试剂与多糖溶液的体积比4∶3，反应时间2 h的条件下完成反应，测定不同反应温度下SAPCP的取代度。

1.3.5 不同反应时间对SAPCP取代度的影响

按照1.3.1的方法，调节反应时间分别为1、2、3、4 h，将 V氯磺酸：V吡啶的比例，在酯化试剂比 1∶3，酯化试剂与多糖溶液的体积比4∶3，反应温度70℃的条件下完成反应，测定不同反应时间下SAPCP的取代度。

1.4 玉米皮多糖硫酸酯化工艺条件优化

在单因素试验的基础上，采用正交试验法确定APCP硫酸酯化的最佳工艺条件。按照酯化试剂比例、酯化试剂与多糖溶液的体积比、反应温度及反应时间做四因素三水平正交试验。

1.5 硫酸基含量的测定及取代度计算

硫酸基含量的测定采用氯化钡-明胶浊度法［7］。

样品预处理：精确称取SAPCP 250 mg，溶于250 mL盐酸（1 mol／L）中，沸水浴4 h使其完全水解。采用氯化钡-明胶浊度法对硫酸基含量进行测定，进而计算样品中的硫的百分含量。

取代度计算公式［8］为：

DS＝（1.62×S）／（32-1.02×S）

式中：S为硫酸酯化多糖中硫的质量分数／%。

1.6 SAPCP抗氧化活性的测定

采用邻二氮菲-Fe2＋氧化法［9］测定离体试验体系中羟自由基的氧化作用。分别按表1加入试剂及多糖样品，摇匀后放入37℃水浴中保温1 h，测定其在536 nm处的吸光度值，清除率计算公式：

表1 邻二氮菲-H2 O2／Fe2＋体系加样表／mL

1.7 数据分析

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 不同酯化试剂比例对SAPCP取代度的影响酯化试剂（氯磺酸∶吡啶）比例对SAPCP的取代度的影响如图1所示。

图1 酯化试剂比例对SAPCP取代度的影响

如图1所示，SAPCP的取代度随着氯磺酸∶吡啶的比例增大而增大；但比例超过1∶3时，多糖的取代度却有所下降。由于氯磺酸是一种含硫酸基的强酸，当氯磺酸含量过高时，会导致多糖部分降解，影响硫酸化效果；而其含量过低时，酯化不完全，取代度降低。因此氯磺酸与吡啶的比例太大或太小都会影响硫酸化效果，故选择氯磺酸与吡啶的比例为1∶3。经单因素方差分析，酯化试剂比例对SAPCP取代度影响显著（P＜0.01）。

2.1.2 酯化试剂与多糖溶液的体积比对SAPCP取代度的影响

酯化试剂与多糖溶液的体积比对SAPCP取代度的影响，如图2所示。

图2 酯化试剂与多糖溶液的体积比对SAPCP取代度的影响

如图2所示，随着酯化试剂与多糖溶液的体积比增大，SAPCP的取代度也随着增大；但超过一定的比例时，取代度却在缓慢的降低。图2中酯化试剂与多糖溶液的体积比为4∶4时取代度最大，当酯化试剂与多糖溶液的体积比过低时，会出现碳化现象；过高时，多糖不能完全被酯化，影响酯化效果。因此选择酯化试剂与多糖溶液的体积比为4∶4。经单因素方差分析，酯化试剂与多糖溶液的体积比对SAPCP取代度影响显著（P＜0.01）。

2.1.3 反应温度对SAPCP取代度的影响

反应温度对与SAPCP取代度的影响如图3所示。

图3 反应温度对SAPCP取代度的影响

如图3所示，随着反应温度的增加SAPCP的取代度先增后减。当温度高于70℃时，取代度降低可能是因为玉米皮多糖在酯化过程中出现碳化现象，影响酯化效果，因此选择反应温度为70℃。经单因素方差分析，反应温度对SAPCP取代度影响显著（P＜0.01）。

2.1.4 反应时间对SAPCP取代度的影响

图4 反应时间对SAPCP取代度的影响

不同反应时间对SAPCP取代度的影响见图4。如图4所示，随着反应时间的增加，SAPCP的取代度呈上升趋势，但随着反应时间的延长，多糖的酯化程度降低。可能因为在高酸性的条件下，酯化时间过长，造成多糖的部分降解所致，因此选择时间为3 h。经单因素方差分析，反应时间对SAPCP取代度影响显著（P＜0.01）。

2.2 玉米皮多糖硫酸酯化的最佳工艺条件的确定

在单因素的基础上，采用酯化试剂比例、酯化试剂与多糖溶液的体积比、反应温度和反应时间四因素进行L9（34）正交试验，以确定玉米皮多糖硫酸酯化的最佳工艺条件。选用因素及水平见表2，正交试验结果见表3，方差分析见表4。

表2 因素水平表

表3 正交试验结果

表4 方差分析

由正交试验结果可以看出，各因素作用主次顺序排序如下：B＞A＞D＞C，与极差分析结果一致，即酯化试剂与多糖溶液的体积比影响最大，其次依次是酯化试剂比例、反应温度和反应时间。由k值可知最佳组合为A2B2C2D2。方差分析结果表明各因素对该酯化反应均极显著。经重复试验验证该最佳条件下多糖的取代度最高，达2.85。因此确定最佳的硫酸酯化工艺为：酯化试剂比例为1∶3，酯化试剂与多糖溶液体积比为4∶4，反应温度为70℃，反应时间为3h。

2.3 SAPCP的抗氧化活性

分别配置浓度为 2、4、6、8、10mg／mL的 SAPCP和APCP溶液，这2种多糖对羟自由基的清除作用如图5所示。

图5 不同浓度的多糖溶液对羟自由基的清除率

从图5中可以看出2种多糖溶液对羟自由基都有清除作用，而且随着溶液浓度的增大，清除作用也在增强。在给定浓度范围内，多糖经硫酸化后对羟自由基清除能力大幅提升，在多糖浓度为10mg／mL时清除率约为原多糖的6倍，高达72%。而SAPCP在低浓度下也表现出较高清除能力，并明显高于高浓度下APCP。方差分析结果表明，多糖浓度对羟自由基清除作用效果显著（P＜0.01）。

由此可见APCP经硫酸酯化后，抗氧化活性明显提高，可能是由于多糖单位的羟基被硫酸基取代后，糖环构象可能扭曲或转变并利于形成非共价键，这些阴离子基团间的排斥作用使糖链链段伸长［10］，而且部分硫酸基可能会和糖环上的羟基形成氢键，因而在糖链局部可能形成螺旋结构，糖链较为伸展，有序性明显增加，从而使其黏度降低，与自由基的结合能力增强［11］。

3 结论

3.1 玉米皮多糖硫酸酯化的最佳工艺条件为：氯磺酸与吡啶的体积比为1∶3，酯化试剂与多糖溶液的体积比为4∶4，反应温度为70℃，反应时间为3h。在此条件下，硫酸化玉米皮多糖取代度达到2.85。

3.2 硫酸化玉米皮多糖对羟基自由基有较高的清除作用，并呈明显的量效关系。

3.3 氯磺酸-吡啶法制备硫酸化玉米皮多糖的工艺可行。

［1］王兆梅，李琳，郭祀远.多糖结构修饰研究进展［J］.中国医药工业杂志，2002，33（12），616-619

［2］AthukoralaY，AhnGN，JeeY-H.Antiproliferativeactivity ofsulfatedpolysaccharideisolatedfromanenzymaticdigestof eckloniacavaontheU-937cellline［J］.JournalofApplied Phycology，2009，21（3）：307-314

［3］YadavMadhavP，ParrisN，JohnstonDB，etal.Cornfibergum andmilkproteinconjugateswithimprovedemulsionstability［J］.CarbohydratePolymers，2010，81：476-483

［4］高利忠，周素梅，殷文政.玉米皮活性多糖的研究进展［J］.粮油加工，2007（11）：114-116

［5］张艳荣，刘相阳，于君，等.玉米皮多糖的组成及结构［J］.食品科学，2011，32（3）：64-67

［6］王文侠，张晓静，宋春丽，等.碱性过氧化氢法提取玉米皮戊聚糖及其氧化交联性质的研究［J］.中国食品学报，2012（10）：96-101

［7］谢佳，张静，柳红.南瓜多糖硫酸酯化衍生物的制备及抗氧化研究［J］.食品工业科技，2008（9）：60-62

［8］张惟杰.糖复合物生化研究技术［M］.杭州：浙江大学出版社，2006

［9］何玲玲，王新，刘彬，等.板栗多糖的分离纯化及抗氧化活性研究［J］.食品与机械，2010，26（2）：73-74

［10］VollmertBruno著.高分子化学基础［M］.黄家贤，等译.北京：化学工业出版社，1986

［11］李国荣，刘娜，张静，等.鸡腿菇多糖硫酸酯化条件的优化及抗氧化活性研究［J］.西北农林科技大学学报：自然科学版，2010（11）：127-133.