刘 静，范佳玮，吕 祥

(上海中医药大学附属市中医医院，上海 200041)

大肠癌是我国常见的恶性肿瘤之一，也是主要的肿瘤死因之一[1]。以上海市为例，2003—2007年大肠癌粗发病率和病死率分别为43.35/10万和22.42/10万，大肠癌的发病率位居全部恶性肿瘤的第2位，病死率位居全部恶性肿瘤的第4位[2]，发病率增速远超2%的国际水平。2013年6月召开的第九届上海国际结直肠癌高峰论坛上报道，我国大肠癌有15%～25%结直肠癌患者在确诊时即合并有肝转移，而有15%～25%的患者在结直肠癌原发灶根治术后发生肝转移，其中绝大多数(80%～90%)的肝转移灶无法获得根治性切除。因此优化大肠癌治疗方案是亟待解决的问题。中医药治疗大肠癌已在临床上获得广泛应用，本实验拟对健脾复方治疗大肠癌的机制进行探讨。

1 实验资料

1.1实验动物 SW620小鼠30只，雌雄不同，正常同养。

1.2血清制备方法 方药血清制备：裸小鼠予健脾复方(由黄芪30 g、党参12 g、炒白术12 g、茯苓12 g、炙甘草6 g、半夏6 g、天龙6 g、红藤30 g、藤梨根30 g、生牡蛎30 g等组成，生药由上海市中医医院药剂科提供，根据处方比例，取适量生药，第1次加13倍水煮沸后1 h保温2 h将药液滤出；第2次加11倍水煮沸后1 h保温2 h将药液滤出。滤液合并浓缩，加入95%乙醇适量(依公式V×60/(95-60))，冷藏静置24 h滤出。将滤液浓缩至流浸膏样，配制成浓度为含生药量3 g/mL，由上海市中医医院制剂室协助制备)灌胃1 mL/d，连续给药1周，最后一次给药后1 h，麻醉后心脏采血，分离健脾复方血清，过滤后灭菌，-80 ℃冰箱保存。正常裸小鼠血清制备：每天用生理盐水灌胃，剂量及血清制备方法同制备。

1.3细胞分离培养方法及分组 大肠癌细胞株SW620由上海市肿瘤研究所提供，用含10%胎牛血清的DMEM培养基，37 ℃ 5%二氧化碳常规培养细胞，取处于指数生长期的SW620细胞，消化、离心、分离成单细胞悬液。将SW620单细胞悬液分别取细胞数5×105接种于96孔板，然后分为3组，空白对照组予正常培养基培养，药物空白组用正常裸小鼠血清按15%浓度与正常培养基混合后培养，健脾复方组用健脾复方含药血清，按15%的浓度与正常培养基混合后培养。贴壁后分别加入透明质酸原液250 μL，终浓度为500 μg/mL。

1.4检测指标 培养72 h后，采用流式细胞技术分析各组CD44的表达情况，采用Western Blot方法检测β-链蛋白(β-catenin)的表达情况。

1.4.1流式细胞检测方法 采用流式细胞仪分析各组CD44的表达情况，计算CD44-APC通过FL4通道的百分率。

1.4.2Western Blot检测方法 试剂由上海基尔顿生物科技有限公司提供。将需要抽提蛋白的细胞从培养箱中取出，适量预冷的1×PBS洗涤2次，加入含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的裂解液，4 ℃充分裂解细胞，将细胞刮入1.5 mL EP管中，95 ℃以上加热10 min，12 000 g离心 10 min，取上清，进行蛋白质定量后贮存于-80 ℃冰箱。配10%分离胶，每孔上样20 μg蛋白，浓缩胶电泳80 V 20 min，分离胶120 V 60 min，半干转膜，并于5%脱脂奶粉封闭，4 ℃过夜。根据说明书，配置1∶1 000稀释抗体的抗β-catenin(Abcam公司，货号Ab86714)的一抗工作液，4 ℃过夜。TBST洗膜3×5 min，根据用量按照1∶1 000稀释HRP标记的二抗(碧云天公司，货号A0208)，与膜37 ℃孵育1 h，用TBST洗膜5 min×3次。发光成像，并与GAPDH灰度值比较，判断蛋白相对表达的变化。

1.5统计学方法 采用SPSS 19.0统计软件进行统计。计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验法。

2 结 果

2.13组CD44表达量比较 空白对照组、药物空白组和健脾复方组的CD44相对表达量分别为0.791±0.008，0.737±0.007，0.533±0.018。经方差分析，3组间比较差异有统计学意义(F=384.102，P<0.001)；经LSD法两两比较，健脾复方组与空白对照组以及健脾复方组与药物空白组间比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。

2.23组β-catenin表达量比较 空白对照组、药物空白组和健脾复方组的β-catenin相对表达量分别为1.396±0.437，1.491±0.467，0.671±0.213。经方差分析，3组间比较差异有统计学意义(F=7.978，P=0.004)；经LSD法两两比较，健脾复方组与空白对照组以及健脾复方组与药物空白组间比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。

3 讨 论

透明质酸是一种由2 000～25 000个葡萄糖醛酸和N-乙酰葡糖胺组成的黏多糖，分子量105～107Da，广泛分布于细胞外基质中。研究显示腺癌释放的因子可刺激肠道间质细胞合成HA[3]，新合成的HA被分泌到细胞表面与其主要的受体CD44相互作用，或释放入周围细胞和细胞外间质中[4]。CD44是黏附分子家族的成员，HA-CD44相互作用可促进SW620肿瘤细胞的侵袭[5]，并可在肿瘤细胞中诱导产生包含CD44和ErbB2或上皮生长因子受体(epithe，EGFR)的复合物，而阻断HA-CD44相互作用可抑制这一复合受体信号复合物的合成[6]。由此可见，内源性HA激活CD44，可影响其下游一系列因子，最终调节肿瘤细胞的生存和增殖，抑制CD44 表达可降低肿瘤细胞的数量和生长[7]。β-catenin是另一个黏附分子家族的重要成员，参与大肠癌的肿瘤侵润和转移，大肠癌中CD44与β-catenin的表达具有一定的相关性[8]，因此阻断细胞黏附分子也可能是大肠癌防治的重要靶点之一。

健脾复方以黄芪合四君子汤健脾益气，以资后天之本，脾气得健，则气生血运，正气得复；配以半夏、天龙、红藤、藤梨根、生牡蛎等解毒散结之品，使肿块得以徐徐消之，全方寓攻于补，攻补兼施，共奏扶正祛邪之功。笔者先前通过大肠癌裸小鼠原位移植瘤模型研究显示健脾复方可显著减轻瘤质量，减少瘤体积和转移灶个数[9]，对HA-CD44下游的因子如EGFR、环氧化酶-2、前列腺素E2、血管上皮生长因子[10-11]等的表达有显著抑制作用，并可进一步促进细胞凋亡[12]。本研究结果显示健脾复方可以抑制HA-CD44相互作用，抑制CD44的表达，并可下调另一重要的细胞黏附分子β-catenin的表达，综合本实验及以往实验研究的结果，笔者推测健脾复方通过抑制CD44和β-catenin表达，从而可能影响其下游一系列与大肠癌发生发展相关的因子，因此起到抑制大肠癌的作用。

[参考文献]

[1] 陈万青，张思维，曾红梅，等.中国2010年恶性肿瘤分布与死亡[J].中国肿瘤，2014,23(1)：1-10

[2] 李德録，吴春晓，郑莹，等. 上海市2003—2007年大肠癌发病率和死亡率分析[J]. 中国肿瘤，2011,20(6)：413-418

[3] Wang C,Tammi M,Guo H,et al. Hyaluronan distribution in the normal epithelium of esophagus, stomach,and colon and their cancers[J]. Am J Pathol,1996,148(6):1861-1869

[4] Toole BP. Hyaluronan:from extacellular glue to pericellular cue[J]. Nat Rev Cancer,2004,4(7):528-539

[5] Kim HR,Wheeler MA,Wilson CM,et al. Hyaluronan facilitates invation of colon carcinoma cells in vitro via interaction with CD44[J]. Cancer Res,2004,64(13):4569-4576

[6] Misra S,Toole BP,Ghatak S. Hyaluronan constitutively regulates activation of multiple receptor tyrosine kinases in epithelial and carcinoma cells[J]. J Biol Chem,2006,281(46):34936-34941

[7] Misra S,Hascall VC,De Giovanni C,et al. Delivery of CD44 shRNA/nanoparticles within cancer cells: perturbation of hyaluronan/CD44v6 interactions and reduction in adenoma growth in Apc Min/+MICE[J]. J Biol Chem,2009,284(18):12432-12436

[8] 姚海燕，张志利. 大肠癌的CD44V6和β-catenin蛋白的表达及相关性研究[J]. 河北医药，2014,36(6)：854-856

[9] 刘静，史勤，吕祥. 健脾复方对人大肠癌移植瘤裸小鼠肿瘤生长转移的影响[J]. 辽宁中医药大学学报，2010,12(8)：57-59

[10] 刘静，史勤，吕祥，等. 健脾复方对人大肠癌移植瘤裸小鼠COX-2, VEGF和EGFR表达的影响[J]. 江苏中医药杂志，2012，44(8):70-72

[11] 刘静，史勤，吕祥，等. 健脾复方对人大肠癌移植瘤裸小鼠COX-2, NF-kb和AP-1表达的影响[J]. 中华中医药杂志，2012，27(7)：1932-1934

[12] 刘静，朱琰，史勤，等. 健脾复方对人大肠癌移植瘤裸小鼠肿瘤细胞凋亡的影响[J]. 实用临床医药杂志，2012，16(13):1-3；12