王立曼，王妍，段翠密，王海滨，王常勇

肝移植是有效根治肝衰竭的方法，然而供体来源有限、费用昂贵等原因限制了肝移植的应用[1]。体外再造肝脏有望为肝衰竭的治疗提供新手段。近年来，基于全器官脱细胞-再细胞化策略的组织工程研究受到了越来越多的关注，发展异常迅速[2-6]。该策略的基础是制备肝脏全器官脱细胞基质支架材料，保留完整的脉管结构及细胞外基质(extracellu lar m atrix，ECM)成分，这是解决再造肝脏营养物质输送问题的关键[7-9]。研究人员相继利用十二烷基硫酸钠(sodium dodecylsu lfate，SDS)[10]、磷脂酶和脱氧胆酸钠[11]、不同浓度Triton X-100[12-14]成功获得脱细胞基质，但其洗脱方法均存在一定不足，如洗脱时间长、ECM破坏严重、生长因子大量丢失等[15]。此外，由于门静脉容易暴露、插管后不宜扭转，因此以往研究主要采用门静脉灌注的方法[9-13]，但是门静脉的管壁较薄，插管后血管很容易破裂，造成洗涤剂外泄。Pan等[16]于2013年采用肝下下腔静脉灌注获得脱细胞基质，但肝下下腔静脉灌注为逆行灌注，不符合生理学特征，静脉瓣膜很可能对灌注带来阻力。目前为止尚未见采用肝动脉插管的报道。本研究采用肝动脉插管的方式，比较不同方法对细胞和核酸成分的去除情况，以及对ECM蛋白成分的影响，以期为筛选更为有效的肝脏全器官脱细胞基质制备方法提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及试剂 SD大鼠购于军事医学科学院动物中心，雌雄不限，体重200～300g。戊巴比妥钠、肝素钠(国药集团化学试剂有限公司)；胰蛋白酶(Sigm a公司，美国)；甲苯胺蓝染液(北京化工厂)；Ⅳ型胶原抗体、纤连蛋白抗体和层黏连蛋白抗体(武汉博士德生物工程有限公司)。

1.2 肝脏全器官脱细胞基质的制备 SD大鼠腹腔注射2%戊巴比妥钠(30m g/kg)麻醉，十字切口打开腹腔，显露门静脉，注射器推注2m l肝素(100U/m l)抗凝。肝动脉行留置针固定，结扎门静脉、肝上下腔静脉，肝下下腔静脉用于洗脱液的外流。游离肝脏周围韧带，切断腔静脉，取出完整肝脏。SDS方案：肝脏－80℃冷冻24h后常温解冻，0.01m o l/L PBS灌注1h，1%SDS灌注3h，0.01m o l/L PBS冲洗24h。Tx(Triton X-100)+SDS方案：肝脏－80℃冷冻24h后常温解冻，以0.01m o l/L PBS灌注1h，1%Triton X-100灌注3h，超纯水冲洗15m in，0.1%SDS灌注2h，0.01m o l/L PBS冲洗24h。灌流速度均为3m l/m in。1.3 三维形态观察和甲苯胺蓝染色 大鼠肝脏脱细胞前后行大体观察。肝动脉灌流0.5%甲苯胺蓝染液，灌流速度0.1m l/m in，体式显微镜下观察脉管结构保留情况。

1.4 HE染色及免疫荧光染色 4%多聚甲醛固定脱细胞基质，梯度乙醇脱水，石蜡包埋、切片(厚3μm)、脱蜡后行HE染色。另取切片脱蜡，3%双氧水去除内源性过氧化物酶，修复，加1%牛血清白蛋白封闭，滴加Ⅳ型胶原、层黏连蛋白、纤连蛋白一抗，4℃过夜；0.01m o l/L PBS清洗3次，Ⅳ型胶原、层黏连蛋白滴加山羊抗小鼠IgG-FITC生物素化二抗(1:200)，纤连蛋白滴加山羊抗小鼠IgG-Cy3生物素化二抗(1:200)，37℃孵育20m in；0.01m o l/L PBS清洗3次，荧光显微镜下观察(DM IRB，Leica，德国)。

1.5 DNA含量检测 采用组织DNA基因组提取试剂盒(TIANGEN公司)提取天然组织和脱细胞基质DNA，采用核酸电泳仪(Bio-Rad，美国)进行琼脂糖凝胶电泳，Bio-Rad核酸蛋白测量仪(Bio-Rad Sm artspecTMPlus，北京赛百奥科技公司)进行定量分析。

1.6 生长因子检测 采用大鼠肝细胞生长因子(HGF)ELISA试剂盒、大鼠碱性成纤维细胞生长因子(b FGF)ELISA试剂盒(上海BLUEGENE生物科技有限公司)检测HGF、b FGF含量。分别称取100m g左右正常肝脏组织和脱细胞基质，匀浆后取上清，设置空白对照组、标准品组、样品组，具体操作按试剂盒说明书进行。测量450nm波长处各孔吸光度(A)值，计算HGF、b FGF含量。

1.7 胶原含量检测 采用酸水解法测定羟脯氨酸含量以反映组织中的胶原含量。制备样品处理液：称取30m g左右的正常肝脏组织和脱细胞基质，于安瓿瓶中加6m o l/L HCl，酒精灯火焰封口后110℃水解24h，然后调节pH至6.5～7.0。制备羟脯氨酸储备液(1m g/m l)，并稀释成梯度浓度标准液(0、2、4、6、8、10μg/m l)。分别取标准液和样品处理液0.5m l，依次加入2m l正丙醇和0.5m l氯胺T试剂，室温放置25m in，然后加入0.5m l恩克里试剂，混匀后65℃水浴20m in。冷却后560nm下测量A值，计算胶原蛋白含量。

1.8 统计学处理 采用SPSS 16.0软件进行分析。计量资料以±s表示，多组间均数比较采用方差分析，进一步两两比较采用Studen t t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 三维形态观察和甲苯胺蓝染色结果 肝脏经两种灌注方法洗脱后，外形结构保持良好，期间逐渐变白并透明化(图1)。肝脏脱细胞基质包膜结构完整，透过肝包膜可以清晰地看到脉管结构。甲苯胺蓝染色显示，SDS方案脱细胞化会对脉管壁造成损害，灌入的染液外泄，而Tx+SDS方案保持了脉管结构的完整性，染液从血管根部一直流向血管分支(图2)。

2.2 组织学检测结果 HE染色未见明显的细胞及细胞成分，肝脏全器官脱细胞基质呈网状结构(图3)。免疫荧光染色显示两种脱细胞方法均能很好地移除细胞核成分，并能保留ECM成分(图4)。SDS方案得到的支架纤维结构松散，网络结构遭到不同程度破坏，未见完整的脉管系统，Tx+SDS方案保留了完好的ECM网状结构，脉管系统保留完整(图3、4)。

图1 肝脏全器官脱细胞基质制备过程(Bar=10mm)Fig. 1 Decellu larization fo r p reparing liver w ho le-o rgan dece llu larized m atrix (Bar=10mm)

图2 肝脏脱细胞基质甲苯胺蓝染色(Bar=10mm)Fig. 2 Toluidine blue staining of liver whole-organ decellularized m atrix (Bar=10mm)

2.3 DNA含量 正常肝脏组织中DNA含量为2955.0±138.1μg/g，SDS方案脱细胞基质中DNA含量为47.4±3.0μg/g，为正常组织的1.60%，Tx+SDS方案脱细胞基质中DNA含量为46.8±4.3μg/g，为正常组织的1.58%。统计学分析显示，两种方案脱细胞基质中DNA含量均明显低于正常肝脏组织，差异有统计学意义(P<0.05)。琼脂糖凝胶电泳未见脱细胞基质中有明显的DNA片段(图5)。

图3 正常肝脏及肝脏全器官脱细胞基质HE染色(Bar=100μm)Fig. 3 HE staining of no rm al liver and liver w ho le-o rgan dece llu larized m atrix (Bar=100μm)

2.4 ECM中胶原及HGF、b FGF的含量 SDS方案脱细胞基质中胶原含量为4.23±0.05μg/m g，明显低于正常组织中的胶原含量(7.54±0.11μg/m g，P<0.05)，表明SDS脱细胞方法会破坏ECM胶原蛋白成分；Tx+SDS方案脱细胞基质中胶原含量为7.76±0.15μg/m g，与正常组织比较差异无统计学意义(P>0.05)，表明Tx+SDS方案能够很好地保留胶原蛋白成分。SDS方案脱细胞基质中HGF含量为11.3±1.8ng/g，明显低于Tx+SDS方案(44.5±2.9ng/g)及正常组织(76.1±4.1ng/g)，且Tx+SDS方案脱细胞基质中HGF含量明显低于正常组织，差异有统计学意义(P<0.05)。SDS方案脱细胞基质中b FGF含量为6.1±0.7ng/g，明显低于Tx+SDS方案(15.9±0.4ng/g)及正常组织(37.6±3.3ng/g)，且Tx+SDS方案脱细胞基质中b FGF含量明显低于正常组织，差异有统计学意义(P<0.05)。

3 讨 论

本研究采用SDS及Tx+SDS方案进行洗脱，均可见肝脏逐步变得透明，但三维结构保持不变。HE染色、免疫荧光染色均未见细胞及细胞核残留，DNA含量分别减少至天然组织的1.60%和1.58%，表明两种方案制备的肝脏全器官脱细胞基质符合脱细胞标准[17]，证实了肝动脉插管的可行性及两种脱细胞方法的有效性。但是两种方法的脱细胞化效果不尽相同：甲苯胺蓝、免疫荧光及胶原定量检测结果表明，SDS方案对ECM成分破坏较大，纤维结构松散，脉管结构不完整，而Tx+SDS方案对ECM成分破坏则较小，维持了肝脏天然的ECM成分和脉管结构。此外，ELISA检测结果显示，相对于SDS方案，Tx+SDS方案可以保留更多的ECM及生长因子成分。

图4 正常肝脏及肝脏全器官脱细胞基质免疫荧光(Bar=100μm)Fig. 4 Imm unefluo rescence of no rm al liver and liver w ho le-o rgan decellu larized m atrix (Bar=100μm)

图5 肝脏全器官脱细胞基质DNA含量检测Fig. 5 Determ ination of DNA content of liver w hole-organ decellu larized m atrix

本研究采用的脱细胞方法结合了物理法和化学法。冻融法是常用的物理脱细胞方法，在冰冻过程中，溶液会形成冰晶，细胞内的小冰晶可胀破细胞膜，有效地破坏细胞结构，但是必需联合其他方法来清除细胞成分。SDS是广泛使用的离子洗涤剂，能溶解细胞质、细胞核和细胞膜，可高效清除细胞核和细胞质内蛋白残留。本研究中SDS方案有效清除了细胞成分，但ECM成分也遭到了严重破坏，这可能是由于SDS破坏了蛋白之间的联系，使蛋白发生变性，导致纤维结构松散。Triton X-100是一种温和的非离子洗涤剂，能够与生物膜中的磷脂等脂质结合形成可溶性复合物，破坏生物膜，它打破了脂质之间和脂质与蛋白间的联系，但保留了蛋白与蛋白之间的联系，因此，以Triton X-100为主要洗涤剂的脱细胞方案能够更好地保护肝脏超微结构和ECM蛋白成分。但单纯的Triton X-100过于温和，洗脱不完全，因此我们结合SDS进一步洗脱以完全去除细胞残留成分，SDS的浓度控制在0.1%，既能发挥很好的洗脱作用，又能较好地保留ECM蛋白[18]。

总体来说，通过Tx+SDS方案制备肝脏全器官脱细胞基质能够更好地保留肝脏三维结构和ECM蛋白成分，维持肝脏ECM的力学、生物学特性，为基于肝脏全器官脱细胞-再细胞化策略的肝脏再造提供了优良的肝脏全器官脱细胞基质材料，有望成为临床上移植供肝的重要来源之一。

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