李依驰，崔 看，陈 锦，成 平，陈良城，夏石头*

(1湖南农业大学生物科学技术学院/湖南省植物激素与生长发育重点实验室，长沙410128;2湖南省西瓜甜瓜研究所，长沙410125;3湖南省农业科学院农业信息与工程研究所，长沙410125)

复制因子C(replication factor C，RFC)最早是从人类的宫颈癌Hela细胞提取物中纯化得到的，由5个大小结构不同的亚基组成的蛋白复合物，并发现它是猿病毒40(simianvirus 40，SV40)DNA在体外复制的必需因子［1，2］。人们以酵母、老鼠、果蝇和人类细胞等为研究材料，相继确定了酵母、老鼠、果蝇和人类细胞中RFC复合蛋白各亚基及其编码基因，并发现很多真核生物中都存在着该蛋白复合物［3～6］。随着研究的不断深入，人们逐渐认识到RFC复合蛋白复合物作为一个整体，其在DNA复制与修复及细胞分裂增殖和抗逆生长中具有重要的功能。而在植物中，Furukawa等［7］在水稻中利用同系物克隆法成功分离了水稻复制因子C(Oryza sativa L.RFC，OSRFC)的5个亚基，分析了其表达部位及其分子特性，自此人们开始对于RFC复合体在植物中的重要作用进行研究。但是由于RFC是DNA复制必需因子，其编码基因突变极可能导致植株死亡，因此有关植物中RFC的报道较少。

1 RFC蛋白复合体的组成与功能

RFC复合物是位于真核生物复制叉上的结构特异性DNA结合蛋白，主要作用是在DNA复制过程中，将增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)装载到DNA链上，并在有脱氧核糖核酸存在的条件下通过人类单链DNA结合蛋白(human single－stranded DNA binding protein，hSSB)的作用而准确高效的延伸 DNA复制链［8，9］。RFC蛋白复合物由5个亚基组成，其1个大亚基(RFC1/140 kD)和4个小亚基(RFC2/37 kD，RFC3/36 kD，RFC4/40 kD，RFC5/38 kD)，普遍存在于真核生物中。而随后在对RFC以及5个亚基的功能研究后发现，RFC以及5个亚基在真核生物中都具有重要的生物学功能［3～6］。

在真核生物复制时，RFC具有激活多聚酶组装的作用［10，11］，同时在 SV40 的 DNA 复制起始点、DNA领头链起始合成中多聚酶由polα转换为polδ时和随后链延伸过程中冈崎片段合成时的作用也是必不可少的。同时RFC复合物整体参与了DNA复制S期细胞周期检查点控制，而RFC的4个小亚基能与Rad24形成一个稳定的结构，参与在S期以外的细胞周期检查点控制的途径［12］。而在细胞分裂时，RFC与Ctf18p、Ctf8p或Dcc1p形成的复合物使姐妹染色单体能够准确的合成，此外，RFC及其亚基在细胞分裂增殖及抗逆性生长等方面也起作用［13～16］。

2 酵母和人类RFC各亚基的功能

酵母RFC的5个亚基都是酵母细胞增殖所必需的，除序列高度相似外，都含有ATP/GTP结合蛋白特性的保守区域。酵母复制因子C(Saccharomyces cerevisiae RFC，ScRFC1)与细胞分裂周期蛋白44(Cell division cycle protein 44，CDC44)相似。CDC44是一个细胞分裂周期基因，其编码蛋白参与DNA代谢。CDC44/RFC1与ScPCNA蛋白编码基因在遗传学水平上相互作用，同时证实了它们在DNA复制时存在着相互作用［17］。与人类 RFC(human RFC，hRFC)活性相似，ScRFC是细胞生长所必需的并表现出单链DNA依赖型ATP酶活性［18］。

通过不断的研究积累，可以推测RFC的各个不同亚基的功能可能也有所不同。2005年，Kim等［19］发现，在裂变酵母中RFC1的C末端结构域是维持其体内功能所必需的，该结构域的突变会导致细胞内染色体复制异常。而RFC1的超表达能够消除因组蛋白H3K56的超乙酰化而引起的细胞死亡［20］。Tang等［21］研究发现，hRFC1在早年衰老综合症(Hutchinson Gilford Progeria Syndrome，HGPS)细胞中存在裂解的现象，导致产生被截短了的RFC1(分子量为75 kD)，这种有缺陷的RFC1影响了DNA复制过程中PCNA和polδ的加载。有趣的是，这个裂解过程可以被一个丝氨酸蛋白酶抑制剂所抑制，这就表明RFC1是被丝氨酸蛋白酶所裂解的。因而这种独特的被截短了的RFC1可以作为一个潜在HGPS的标志。而RFC2、RFC3与c－MYC致癌基因(转录因子)的相互作用，能引发细胞的分裂增生［22］。崔金全等［23］通过基因表达谱芯片检测发现，葡萄胎和绒毛膜癌存在RFC高表达，而RFC2与DNA的复制和修复及细胞周期信号检查点的功能有关，还与PCNA一起参与细胞DNA损伤后的错配修复和切除修复机制。研究发现，人类RFC5是结合到PCNA的C末端的，人类RFC5在人类乳头状瘤病毒(Human papillomaviruses，HPV)病毒呈阳性的头颈鳞片状的细胞瘤(squamous cell carcinoma of the heda and neck，SCCHN)中的表达量上调［24］，且RFC5是打开DNA复制夹PCNA所必需的，RFC1则不是打开PCNA所必需的。RFC5可与Ctfl8结合形成Ctfl8－RFC5，并在DNA复制和姊妹染色体配对中起重要作用［25，26］。Gellon等最近的研究结果则表明，除在姊妹染色体配对中起作用外，Ctfl8－RFC在基因组稳定性方面也有重要作用［27］。

3 植物RFC各亚基的功能

虽然人类和动物中关于RFC的功能研究进展很快，但植物中有关RFC及其各亚基的研究却因起步较晚、研究的关注点不同等多方面的原因，鲜有报道。直到2003年，Furukawa等［7］通过同系物克隆在水稻中成功分离了OsRFC的5个亚基，且5个亚基分别位于水稻的不同染色体上:OsRFC1(位于11号染色体上，110.8 kD)、OsRFC2(位于12号染色体上，37.4 kD)、OsRFC3(位于 2号染色体上，40.3 kD)、OsRFC4(位于 4号染色体上，36.8 kD)和OsRFC5(位于3号染色体上，40.5 kD)。OsRFC的5个亚基都含RFC蛋白高度保守的氨基酸花边序列——RFC盒(RFC box)。这些亚基在不同组织中表达类型不同，在分生组织、茎尖分生组织中表达很强，而在不含分生组织的成熟叶中表达量很低。但由于在水稻中未能获得相应的RFC突变体植株，因此难以在水稻中继续对RFC的功能进行研究。其主要原因可能是RFC复合蛋白体是DNA复制的必需因子，其编码基因突变会导致植株死亡。

为了进一步研究RFC在植物中的功能，夏石头等［28］以拟南芥为载体，研究了 AtRFC1的3个TDNA插入突变株系rfc1－1、rfc1－2和rfc1－3，并发现T－DNA在AtRFC1外显子中插入突变将引起种子胚胎发育异常从而导致种子败育。将野生型AtRFC1通过农杆菌介导法转入到拟南芥突变体中时，却恢复了突变株的野生型表型，进一步说明AtRFC1在种子胚胎发育中起重要作用，AtRFC1突变是导致胚胎发生异常和种子败育的原因。有研究发现，rfc1可解除ros1－1(repressor of silencing1－1)对基因沉默的转录抑制，重新激活ros1－1突变体中35SNPTII(外源导入基因)的表达，表明AtRFC1可能在拟南芥基因组稳定性和基因转录沉默(transcriptional gene silencing，TGS)中起重要作用［29］。同时，At-RFC1缺陷将导致拟南芥对DNA损伤敏感性提高和高概率的同源重组，在减数分裂期，RFC1对于DNA后随链的形成有重要作用，rfc1突变将导致不正常的染色体联结，花粉的败育和其他细胞学的缺陷等［30］。进一步的研究发现，AtRFC1在ABA调节的同源重组中起着至关重要的调节作用［31］。夏石头等通过EMS诱变，得到了一个叶型和株型与SA诱导型抗病突变体sni1(suppressor of npr1－1，inducible 1)相似，即株型较小、早花、叶片狭长且叶面积较小的突变体。sni1是在对病程相关蛋白不表达的突变体npr1(nonexpressor of PR genes)进行抑制突变时筛选出来的，SNI1在水杨酸诱导型抗病反应中起重要作用。通过杂交试验表明，该突变体不是sni1，而是一个新的突变体。通过对该突变体进行基因图位克隆，夏石头等确定该突变是AtRFC3基因的点突变rfc3－1，该点突变导致RFC3中第三个非常保守的结构域中的一个非极性脂肪族氨基酸(Gly－85)被替代成为一个带负电荷的氨基酸(ASP)，从而影响了RFC3与其他亚基的结合［32］。与野生型相比，rfc3－1植株对病原菌Peronospora parasitica(P.p.)Noco2的抗性显著增强，检测突变体内抗病基因PR1和PR2的表达分析发现，rfc3－1植株PR1和PR2基因表达量大幅上调;更进一步研究发现，该上调是不依赖于 NPR1蛋白的，说明RFC3在SA诱导的植物系统获得性抗性中起负调控作用［33］。

同时，RFC3基因突变严重影响植株的生长发育，并削弱了植株抗紫外辐射的能力，说明RFC3在植物生长发育中也有重要的生物学功能［34］。陈良城等［35］发现，rfc3－1植株对 MMS与 cisplatin的抗性减弱，而rfc3－1/RFC3植株与野生型没有差异，说明RFC3对植物核酸损伤修复有重要作用。陈良城［36］对拟南芥RFC5进行RNAi干扰，获得 rfc5突变体，对其研究发现，rfc5突变体具有相对于野生型要矮小，侧根少，叶片细小，花器官生长受限等生长发育特征。通过对rfc5突变体进行DNA毒性物质MMS和cisplatin处理实验，发现rfc5突变体抗性减弱，而 rfc5/RFC5植株与野生型没有差异，说明RFC5对植物核酸损伤修复有重要作用。

4 展望

虽然近年来，在对水稻和模式植物拟南芥的RFC及各亚基的功能研究方面已经获得一些进展，但仍存在许多问题，如rfc3－1突变体纯合子植株与另一个突变体sni1在形态和抗病表型上很相似，这两种蛋白是否存在相互作用或者联系?植物中复制因子C复合物其他小亚基如RFC2和RFC4的功能如何?RFC与其他突变表型类似的基因之间是否存在着相互作用?整个作用通路与信号转导系统又是怎样工作的?这些问题都值得更深入的研究和探讨。

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