唐文涛

摘要：在硝基苯胺类化合物的检测过程中一般会采用高效液相色谱以及气相色谱对其进行检测，但是检测周期较长，需要较大的经济成本，不足以满足快速鉴定诊断的需求。文章对水中硝基苯胺类化合物酶免疫化学分析技术进行了综合性的阐述，通过相关实验对该技术进行了探析，供大家参考。

关键词：硝基苯胺类化合物；酶免疫化学；分析技术；液相色谱；气相色谱

中图分类号：X832 文献标识码：A 文章编号：1009-2374（2013）35-0049-02

硝基苯胺类化合物有着很大的毒性，能够经皮肤以及呼吸道吸收。如果吸收量过大便会诱发产生高铁血红蛋白，从而使人体出现缺氧以及紫绀等症状，这对于整个神经系统会带来较大的危害，如果中毒进一步加深将会直接威胁到生命安全。硝基苯胺类化合物还会诱发溶血性贫血。随着我国农业、工业的不断发展，硝基苯胺类化合物的使用范围也越来越广，在医药、农药、工业染料等方面都有着十分广泛的作用。因此硝基苯胺类化合物的检测也被越来越重视。在传统的检测中主要是以色谱柱技术为主，包括了GC、HPLC、GC/MS以及HPLC/MS。相对而言色谱柱技术检测时间较长、操作较为繁琐同时需要较高的经济成本，这就让硝基苯胺类化合物检测的效率受到了一定的影响。近年来随着酶免疫化学分析技术的不断成熟，酶联免疫吸附受到了很大的关注，其应用领域也在不断延伸。通过将硝基苯胺类化合物检测与酶联免疫吸附结合起来，可提高硝基苯胺类化合物检测的精确度并达到缩短检测时间的目的。

1 实验器材、试剂以及动物

实验试剂：戊二醛、4-硝基苯乙胺、牛血清白蛋白和卵清蛋白、兔血清、四甲基联苯胺、羊抗兔IgG-HRP、弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂（试剂均为分析纯）。

实验器材：磁力搅拌、高速冷冻离心机、酶联免疫检测仪、紫外分光光度计、96孔酶标板。

实验动物：雄性大白兔。

2 实验步骤

2.1 合成完全抗原

图1 4-硝基苯乙胺、BSA偶联

将戊二醛以及BSA进行反应，保证戊二醛过量，让酶分子仅与其中的一个醛基进行结合。反应以后用凝胶过滤层进行过滤，得到BSA-戊二醛复合物，再加入4-硝基苯乙胺进行偶联，如图1所示。包被抗原制备与上述方法一致，将BSA更替为OVA，并加入过量的赖氨酸让过量醛基反应。

2.2 完全抗原性能鉴定

利用紫外分光光度计对硝基苯乙胺以及BSA偶联进行相应的鉴定，在波长为200～400nm的紫外光照下测定相关的吸光值，并对其进行激光解吸附电离飞行时间质谱（需要紫外扫描计算基质辅助）来测定偶联物中4-硝基苯乙胺与蛋白的摩尔比。在整个偶联反应过程中会出现多聚物甚至是沉淀，所以在分析的过程中也需要对副反应程度进行分析。在此基础上采用SDS-PAGE凝胶电泳对硝基苯乙胺完全抗原的构成进行测定。

2.3 抗体制备

采集免疫血清之前雄性大白兔的血样作为对照，以PBS对免疫原复合物（4-硝基苯乙胺-BSA）进行稀释，得到梯度浓度（100ug/只、150ug/只、200ug/只），然后再给予注射。在第一次注射的过程中，将等体积完全福氏佐剂加入到4-硝基苯乙胺之中（1mL）以达到乳化效果，之后再进行注射，隔周以后加强免疫注射，共加强三次，若最后得到的抗血能够超过1∶1×104就可以提取使用。需要注意的是，在进行血液采集之前应该先让雄性大白兔禁食，避免血脂过高。采集血液之后静置1小时，之后对血液凝集进行离心，分离出血清，装管。离心温度为4℃，转速为5000～7000r/min，时间控制在10～15min。

2.4 抗体纯化

经过离心得到的抗血清以辛酸-硫酸铵进行纯化，再通过电泳法来测定多克隆抗体分子量区间。

2.5 酶联免疫吸附操作流程

主要步骤为包被抗原→洗涤→添加封闭液→添加检测血清→添加羊抗兔IgG→添加入四甲基联苯胺溶液→添加终止液。

2.6 效价评定

对抗血清与对照血清进行逐级稀释，对照血清中加入100uLPBS，并以酶联免疫吸附方法来测定相关效价，多次测定后以最大稀释倍数作为最终效价。

2.7 构建ic ELISA方法

将4-硝基苯乙胺-OVA在缓冲液当中稀释，浓度为0.5ng/L。将稀释之后的4-硝基苯乙胺-OVA加入到酶标板上（每孔50uL），在密封之后除去包被抗原，并进行洗涤。添加封闭液温育，加入梯度4-硝基苯乙胺以及抗体，抗体量为60uL，再次进行温育（温度控制在37℃，时间为1小时），将抗血清除去并进行洗涤。之后加入了酶标二抗工作液（每孔100uL），温育1小时，温度为37℃。以Logistic模型来确定检测范围。

2.8 特异性检测

采用以下公式来测定交叉反应率：

交叉反应率=4-硝基苯乙胺抑制率50%时所需的浓度/结构类似物50%时所需的浓度×100%

结构类似物包括了邻硝基苯胺、间硝基苯胺、对硝基苯胺、甲苯、苯胺。

3 结果评测

图2 4-硝基苯乙胺棋盘实验

采用以下公式对半抗原与载体的结合比进行计算：摩尔消光系数（ε）=吸光值/摩尔浓度；结合比=[ε280（偶联物）-ε280（载体蛋白）]/ε280（半抗原）；另外还可以通过飞行时间质谱来进行结合比的计算：结合比=（完全抗原分子量-载体蛋白分子量）/半抗原分子量。

上述公式中ε280为完全抗原和载体蛋白在280nm的紫外吸收值的变化及半抗原在该波长处的摩尔消光系数。通过多克隆抗体纯化效果鉴定以及多克隆抗体效价测定来分析得到相关的血清效价检测结果，具体如下：

通过方阵实验来确定酶联免疫吸附方法的工作条件，首先应该将反应控制在灵敏区域，也就是说抗原出现变化时，吸光值将会呈现出相应的变化。将反应控制在抗原浓度较小的区域，从而达到节约试剂的效果，并且也可以从一定程度上降低特异性吸附作用。通过处理得到以下

曲线：

图3 4-硝基苯乙胺间接竞争ELISA标准曲线

4 结语

在整个实验过程中其核心是建立相关的酶联免疫吸附方法，并以该方法为基础对硝基苯胺类化合物进行测定。此方法操作较为简便并且周期较短，重复性以及灵敏性都处于较高的水平。其整体稳定性相对来说要优于色谱法，在水环境下可以对硝基苯胺类化合物进行较为迅捷的

检测。

参考文献

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