王晓凑，薛庆华，晏馥霞，李立环，刘晋萍，李守军，胡盛寿

（1.温州医科大学附属第二医院 麻醉科，浙江 温州 325027；2.中国医学科学院北京协和医学院阜外心血管病医院 麻醉科，北京 100037；3.中国医学科学院北京协和医学院阜外心血管病医院 体外循环科，北京 100037；4.中国医学科学院北京协和医学院阜外心血管病医院 心脏外科，北京100037）

新生儿和婴幼儿先天性心脏病体外循环（cardiopulmonary bypass，CPB）心脏手术可引起肾损伤，据Kwiatkowski等[1]报道，该类手术急性肾损伤发生率高达6%～28%。CPB后急性肾损伤的机制尚未完全阐明，目前研究[2]认为炎症反应所触发的肾血管内皮损伤，及其引起的肾血管通透性增加和组织灌注不足为其主要机制。本研究旨在通过幼猪深低温低流量CPB心脏手术期间应用广谱蛋白酶抑制剂乌司他丁，探讨其对肾损伤作用的影响及其可能的机制。

1 材料和方法

1.1 材料 北京长白幼猪15例（北京怀革养殖场提供），采用随机数表法分为乌司他丁组（U组，n=5）、对照组（C组，n=5）和假手术组（S组，n=5）。雌雄不计，日龄（18±3）d，术前禁配方乳6 h，禁水4 h。实验方案经阜外心血管病医院伦理委员会批准后实施。

1.2 麻醉方法 为降低动物围术期的病死率，本研究采用模拟临床小儿心脏手术的麻醉管理方法[3]，简述如下。实验动物肌注氯胺酮10 mg·kg-1、咪唑安定0.5 mg·kg-1、阿托品0.05 mg·kg-1，待动物安静后连接心电监护并开放静脉。麻醉诱导用哌库溴铵1.5 mg·kg-1、咪唑安定0.25 mg·kg-1、芬太尼20μg·kg-1静脉注射。诱导时用自制简易呼吸面罩手控球囊控制通气。气管插管后接麻醉机（Drager Primus，Drager公司，德国），给予机械通气，吸入1.0%～1.5%七氟烷。中心静脉、颈内动脉切开置管，接压力感受器。U组和C组分别在切皮前、CPB前、复温开始后、CPB停机后给予哌库溴铵0.5 mg·kg-1、咪唑安定0.2 mg·kg-1、芬太尼100μg·kg-1静脉注射。术中根据监测指标和血气分析维持循环、内环境稳定。维持动脉血酸碱度7.35～7.45，氧分压80～120 mmHg，二氧化碳分压35～45 mmHg，氧饱和度95%～100%，剩余碱±2.3 mmol·L-1，血红蛋白＞8.5 g·dL-1，钠离子135～145 mmol·L-1，钾离子3.5～4.5 mmol·L-1。

1.3 心脏手术与CPB U组和C组实验动物麻醉后仰卧位正中开胸，主动脉、右心耳插管后开始并行循环，鼻咽温降至34 ℃，阻断主动脉，主动脉根部灌注Thomas心肌停跳液10～15 mL·kg-1，间隔30 min加灌一次，心脏停跳，逐渐降温。体温降至25 ℃时，开始低流量（50 mL·kg-1·min-1）循环，主动脉阻断120 min后复温，体温升至30 ℃开放主动脉。全流量循环辅助30 min左右，鼻咽温升至35～36 ℃时调整停机。CPB前给予全量肝素300～400 IU·kg-1，激活全血凝血时间＞500 s，停机后给予等量鱼精蛋白。观察2 h后取右肾上极肾组织。为观察确切的肾保护作用，采用2倍于临床剂量（1.2万IU·kg-1）的乌司他丁，即U组在CPB开始和循环开放即刻分别在CPB管道中给予乌司他丁（生产批号：H19990134，广东天普生化医药股份有限公司）1.2万IU·kg-1，C组给予等量0.9%氯化钠溶液。S组实验动物麻醉后开胸，即取右肾上极肾组织。实验结束，所有动物静脉注射5%氯化钾5 mL处死。

1.4 检测指标和方法 实验动物在麻醉诱导后即刻（T1）、U组和C组在停机后5 min（T2）、120 min（T3）取静脉血，于5 ℃ 3 000 r/min离心15 min离取血清置于-80 ℃冰箱冻存。检测指标：①胱抑素C（CysC）、白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）酶联免疫分析试剂盒均购于美国R&D公司，血清解冻后按说明书采用ELISA法检测上述指标。②血肌酐（SCr）、尿素氮（BUN）采用全自动生化分析仪（贝克曼DXC800，美国）检测。所有动物在实验结束时，用注射器抽取膀胱中尿液2 mL，-80 ℃冻存，解冻后采用颗粒增强散射免疫比浊法测N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（NAG），试剂由美国Behring公司提供；取右肾上极，用10%甲醛固定48 h后行石蜡包埋，切片后HE染色，结果于光学显微镜下观察，采用半定量分析方法进行肾损伤评分[4]。

1.5 统计学处理方法 应用SPSS 16.0软件进行统计学分析。计量资料用 ±s表示，组间比较采用单因素方差分析，组内比较采用重复测量设计的方差分析，两两比较采用LSD-t检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况 所有动物均完成至实验结束，幼猪体质量（4.8±1.7）kg，麻醉诱导时间为（6±2）min后开始安静，U组CPB转机（189±11）min，C组CPB转机（183±12）min（P＞0.05）；U组主动脉阻断（128±10）min，C组主动脉阻断（136±13）min（P＞0.05）；U组麻醉维持时间（342±18）min，C组麻醉维持时间（339±21）min（P＞0.05）。

2.2 血清CysC、SCr、BUN、IL-6和TNF-α检测结果 三组动物在T1时点的CysC、SCr、BUN、IL-6、TNF-α差异均无统计学意义（均P＞0.05）。在各自相同时点，U组和C组的上述检测指标对比如下：在T2时点，U组的CysC、SCr、BUN、IL-6、TNF-α比C组分别降低12.50%（P＞0.05）、2.97%（P＞0.05）、0.37%（P＞0.05）、26.28%（P＜0.05）、10.81%（P＜0.05）；在T3时点，U组的CysC、SCr、BUN、IL-6、TNF-α比C组分别降低24.37%（P＜0.05）、17.20%（P＜0.05）、16.82%（P＜0.05）、18.12%（P＜0.05）、8.57%（P＞0.05）。就C组而言，T2时点的CysC、SCr、BUN、IL-6、TNF-α比T1时点分别升高23.61%（P＜0.05）、22.78%（P＜0.05）、28.07%（P＜0.05）、44.21%（P＜0.05）、12.12%（P＜0.05），T3时点的CysC、SCr、BUN、IL-6、TNF-α比T1时点分别升高64.79%（P＜0.05）、65.56%（P＜0.05）、73.82%（P＜0.05）、45.26%（P＜0.05）、6.06%（P＞0.05）。就U组而言，T2时点的CysC、SCr、BUN、IL-6、TNF-α比T1时点分别升高13.79%（P＞0.05）、19.11%（P＞0.05）、19.16%（P＜0.05）、7.45%（P＞0.05）、6.45%（P＞0.05），T3时点的CysC、SCr、BUN、IL-6、TNF-α比T1时点分别升高31.11%（P＜0.05）、37.05%（P＜0.05）、35.02%（P＜0.05）、20.21%（P＜0.05）、3.22%（P＞0.05）。具体数据见表1。

表1 血清CysC、SCr、BUN、IL-6和TNF-α检测结果（n=5， ±s）

2.3 病理和尿NAG检测结果 U组和C组均见肾损伤表现。与U组比较，C组肾组织HE染色10×40镜下观察可见肾小管呈不同程度水肿， 部分伴间质水肿和/或少量炎性细胞浸润，部分可见小管细胞空泡变性，肾小球未见明显病理改变；S组为正常肾组织，见图1。半定量评分结果显示：C组（5.4±0.07）高于U组（3.8±0.3）（P＜0.05）。U组尿NAG结果为（13.30±2.23）U·L-1，C组为（27.24±4.53）U·L-1，与C组相比，U组尿NAG降低了51.17%（P＜0.05）。

3 讨论

图1 肾组织病理学检查结果（HE，×400）

急性肾损伤仍是CPB心脏手术的严重并发症之一，当肾损伤患者病程发展到需要连续肾脏替代疗法治疗时，病死率高达68%，而生还者大多数需要长期依赖透析治疗，可见肾损伤严重影响心脏手术疗效[5]。由于肾组织代偿调节功能的不成熟，新生儿和婴幼儿CPB心脏手术更易并发急性肾损伤。为模拟小儿肾脏组织，本研究采用相当于人类月龄7～10个月的低龄幼猪。C组在CPB停机后5 min、120 min的肾损伤指标CysC、SCr、BUN均高于麻醉诱导后即刻，尿NAG高于S组，肾组织病理检查可见损伤改变，提示，深低温低流量CPB心脏手术对低龄生物存在肾损伤作用，这与多数同类研究[6-8]结果相一致。

炎症反应是CPB肾损伤的主要触发因素[9-12]。CPB期间，血液与人工心肺机的异物表面相接触、手术创伤、器官的缺血-再灌注等可诱发单核巨噬细胞及中性粒细胞等炎症细胞的聚集和活化，进而释放炎症因子。炎症因子和炎症细胞又可发生联级、放大效应，进而触发全身炎症反应综合征最终导致肾小管破坏[10]。此外，血红细胞破外释放的游离血红蛋白致使肾小管阻塞而导致的肾小管细胞坏死，更加剧了肾损伤[11]。血清IL-6和TNF-α是炎症反应的重要标记物之一，可在早期出现升高。本研究结果也证实，与麻醉诱导后即刻相比，C组在CPB停机后5 min、120 min的血清IL-6和TNF-α均出现升高。因此，如何减轻CPB期间的炎症反应成为减轻CPB期间肾损伤的重要研究方向。

乌司他丁是一种从健康成年男性尿液中分离纯化的尿胰蛋白酶抑制剂，能够抑制多种蛋白酶的活性和炎性因子的释放以及稳定溶酶体膜防止水解酶的外溢，临床上主要用于治疗急性胰腺炎、急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征、全身炎症反应综合征、多器官功能障碍综合征等。本研究显示，U组在CPB停机后5 min、120 min肾损伤指标CysC、SCr、BUN低于C组，在实验终点时尿NAG低于C组；病理学检查示U组肾损伤程度轻于C组，肾损伤半定量评分低于C组。提示乌司他丁对幼猪CPB心脏手术具有肾保护作用，这与同类研究[13-14]结果相一致。U组在CPB停机后5 min、120 min炎症反应指标血清IL-6和TNF-α均低于C组，提示乌司他丁通过抑制炎症因子的释放减轻炎症反应，从而起到肾保护作用。此外，Nishiyama等[15]的研究表明，乌司他丁可通过抑制红细胞破坏，降低游离血红蛋白含量，从而减少游离血红蛋白在肾小管的阻塞，达到肾保护作用。

本研究存在如下不足：首先，我们仅对常见的早期炎症反应指标IL-6和TNF-α进行了检测，检测指标未包括该类指标的上游产物（如相关的mRNA）和相关调控因子（如NF-κB），因此，乌司他丁抑制CPB心脏手术炎症反应链中的目标环节及其机制仍有待进一步的研究；其次，在数据采集点的设计上，我们仅对麻醉诱导后即刻（作为基准值），停机后5 min（反映CPB后检测指标的变化）和停机后120 min（临床上急性肾损伤出现率较高的时点）的相关指标进行采集，实验终点即处死实验动物，未对其远期肾功能变化及其存活率进行监测；再次，我们未对肾血管通透性进行研究，CPB引发的急性炎症反应以及肾缺血-再灌注损伤可引起肾血管通透性增加，乌司他丁是否通过作用于肾血管通透性达到肾保护作用，需要进行进一步的研究。

通过本研究，我们发现深低温低流量CPB心脏手术对幼猪存在肾损伤，乌司他丁可通过抑制炎症反应达到对抗肾损伤（肾保护）的作用。

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