洪德芳，艾冬冬，丁麟超，吕建新，钟连进，厉保秋，高丽昌，金丽琴

（1.温州医科大学 检验医学院、生命科学学院，浙江 温州 325035；2.山东弘立医学动物实验研究有限公司，山东 济南 250101）

白细胞介素（IL）-18是一种炎症和免疫增强因子，刺激Th1细胞和NK细胞分泌干扰素γ（IFN-γ），明显增强Th1免疫反应，具有良好的抑制肿瘤作用[1-2]。然而由于IL-18的效应细胞广泛分布于人体全身，易引起全身的炎症反应。表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）在许多恶性肿瘤细胞表面均过度表达，对一些恶性肿瘤细胞的细胞周期、增殖及侵袭等方面起关键作用[3-5]。有研究表明，EGFR配体的第三个环状结构保守基序（C-loop）可特异性与肿瘤细胞表面的EGFR结合但并无活化EGFR的功能[6]。因此，彭颖等[7-9]通过融合EGF受体干扰基序和IL-18成熟肽分子，构建了一种能靶向结合肿瘤细胞的rhEGF-IL-18融合蛋白，并将其在毕赤酵母系统中进行表达。

为了进行rhEGF-IL-18融合蛋白在动物体内的药代动力学研究，为后续的临床试验打下基础，需要建立一种可靠的血药浓度检测方法。为此，本研究选择了比较具有代表性的食蟹猴进行给药，针对蛋白类药物的特点建立了检测给药食蟹猴血清中rhEGF-IL-18融合蛋白浓度的直接竞争ELISA方法，并对其进行了方法学评价。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 药品及抗体：rhEGF-IL-18标准品（1 000 μg/mL）由温州医科大学提供；抗rhEGF-IL-18抗体血清由山东弘立医学动物实验研究有限公司提供；抗rhEGF-IL-18抗体和酶标抗原委托北京博奥森生物技术有限公司纯化制备。

1.1.2 主要仪器及试剂：多功能酶标仪（OLYMPUS）；96孔可拆酶标板（CORNING）；高速低温离心机（BeckMan）；食蟹猴空白血清（山东弘立医学动物实验研究有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 ELISA操作流程：①包被：将稀释到工作浓度的抗rhEGF-IL-18抗体加入到ELISA板条中，每孔100μL，4 ℃中包被过夜。②封闭：每孔加入200μL的封闭液（0.01 mol PBS 15倍稀释1.5%干酪素），37 ℃ 2 h后甩干，放4 ℃备用。③加样：将rhEGF-IL-18稀释到规定浓度后加入包被板条中（100μL/孔），样品稀释液（0.01 mol PBS 30倍稀释1.5%干酪素）中含有50%的食蟹猴空白血清；关于待测的rhEGF-IL-18样品：每孔加50μL的样品稀释液，再加50μL的待测样品。将酶标板在37 ℃恒温箱中放置60 min后，用洗液（含0.05%吐温的0.01 mol PBS）洗板5次并拍干。④加酶标抗原：将稀释到工作浓度的酶标抗原（100μL/孔）加在ELISA板孔底部，37 ℃孵育30 min后洗板5次并拍干。⑤显色：在酶标板每孔中加入100μL TMB显色液，37 ℃中避光显色10 min。⑥终止：每孔加入50μL反应终止液（2 mol/L硫酸），终止反应。⑦检测：以450 nm波长检测各孔OD值。

1.2.2 包被抗体和酶标抗原工作浓度的确立：用棋盘法确定包被的抗rhEGF-IL-18抗体和酶标抗原最佳工作浓度，分别将包被的抗体稀释为一系列浓度：0.5、1、2、3、4、5、6、10μg/mL；酶标抗原做1:500、1:1 000、1:2 000、1:3 000、1:4 000和1:5 000稀释，进行ELISA法测定。同一酶标抗原浓度下，OD450值随包被抗体倍比而成倍比时的浓度为酶标抗原理想工作浓度，最后选择OD450值在1.5～2.0时的包被抗体浓度为其理想工作浓度。

1.2.3 标准曲线的绘制：在上述确定的最佳反应条件下，用样品稀释液将1 000μg/mL的rhEGFIL-18标准品配制成浓度分别为100、200、300、400、500、600、700、800和900 ng/mL进行ELISA法测定，每个浓度5个样本。以未加rhEGF-IL-18标准品的孔为阴性孔，测定各孔的OD450。以OD450值为横坐标，rhEGF-IL-18标准品浓度为纵坐标绘制标准曲线。

1.2.4 方法学评价：①稳定性：用样品稀释液将1 000μg/mL的rhEGF-IL-18标准品配制成浓度分别为200、400、800 ng/mL的溶液，每个浓度5个样本，分别于室温下放置1 h，ELISA方法测定样品浓度，评价短期室温放置条件下样品的稳定性；于冰箱-20 ℃贮存24 h取出室温解冻，按ELISA方法测定样品浓度，重复一次；于冰箱-20 ℃贮存，于第0、第6、第20天取出室温解冻，ELISA方法测定样品浓度，评价冻存稳定性。②精密度和准确性：用样品稀释液将1 000μg/mL的rhEGF-IL-18标准品配制成浓度分别为200、400、800 ng/mL的溶液，按照ELISA方法测定样品浓度，每个浓度5个样本，连续配制、测定3 d，根据样品结果计算准确度与精密度。③回收率：食蟹猴空白血清90 L，分别加入2、4和8μg/mL的rhEGF-IL-18溶液10 L，使得空白血清中rhEGF-IL-18的浓度为200、400、800 ng/mL，混匀后，ELISA方法测定每个浓度5个样本。回收率=样品浓度/配制浓度×100%。④定量下限：食蟹猴空白血清90 L，加入0.2μg/mL的rhEGF-IL-18溶液10 L，使得空白血清中rhEGF-IL-18的浓度为20 ng/mL，混匀后，ELISA方法测定6个样本。

1.3 统计学处理方法 采用Excel软件计算血清药物浓度个体值、均值（ ±s）、标准差（SD或S）、相对标准差（RSD）和相对偏差（RE）。

2 结果

2.1 包被抗体和酶标抗原工作浓度的选择 在不同包被抗体浓度下，以酶标抗原稀释倍数为横轴、OD450为纵轴绘制反应曲线（见图1）。从图中可以看出，当包被抗体浓度为4μg/mL、酶标抗原稀释倍数为1 000倍时，OD450值随包被抗体倍比而成倍比，且在1.5～2.0左右。

2.2 标准曲线的绘制 在上述最佳反应条件下，制备ELISA标准曲线（见图2），并作相关回归分析，其回归方程为y=486.74x2-1693.7x+1478.5，R2=0.9898，标准曲线范围为100～900 ng/mL，反映了本检测法的可靠性。

图1 包被抗体和酶标抗原不同工作浓度下的ELISA法检测

2.3 稳定性评价 每个浓度设置5个重复样本进行冻融，结果表明rhEGF-IL-18血清样品室温放1 h、冻融2次和冻存20 d均较稳定，RSD均明显小于15%（见表1-3）。

表1 rhEGF-IL-18样品室温放置1 h稳定性实验

表2 rhEGF-IL-18样品反复冻融2次稳定性实验

表3 rhEGF-IL-18样品冻存20 d稳定性实验

2.4 精密度与准确性评价 每个浓度设置5个重复样本，连续测定3 d。结果显示日内精密度及日间精密度变异系数（RSD）均在2.5%以内，准确度（RE）均小于3%（见表4）。

表4 ELISA法测定rhEGF-IL-18准确度与精密度

2.5 回收率评价 每个浓度设置5个重复样本，回收率=样品浓度/配制浓度×100%。本法测定rhEGFIL-18在食蟹猴血清中浓度药物为200 ng/mL、400 ng/mL、800 ng/mL的回收率为95.3%～103.0%（见表5），符合回收率80%～120%的标准。

表5 rhEGF-IL-18在食蟹猴血清中的提取回收率

2.6 定量下限研究 设置6个重复样本进行研究。本方法的定量下限为20 ng/mL，变异系数（RSD）在5%以内，准确度（RE）小于3%（见表6）。

表6 ELISA法测定EGF-IL-18最低定量下限

3 讨论

随着人们对肿瘤基因及其发展机制的不断深入研究，针对肿瘤发生发展进程中关键分子的特异性治疗已逐步取代传统的细胞毒性药物筛选成为肿瘤药物研发中的热点[10]。由于低毒性和高特异性等优点，分子靶向治疗在肿瘤治疗中发挥越来越重要的作用[11]。rhEGF-IL-18融合蛋白是一种新型的肿瘤靶向细胞因子，可使效应细胞与肿瘤细胞发生特异性近距离接触。融合蛋白能与效应细胞表面的IL-18受体和肿瘤细胞表面的EGFR结合，从而起到共价桥联作用，能更有效地发挥免疫激活作用。rhEGFIL-18融合蛋白不仅能诱导杀伤局部肿瘤细胞，还能通过免疫网络激活和放大抗肿瘤免疫作用[12]。

目前测定生物体内蛋白多肽药物的方法主要有免疫分析法、同位素标记示踪法和生物测定法。相较于其他两种方法而言，免疫分析法具有经济、快速和灵敏等优点。ELISA法是免疫分析法中使用最频繁的，具有操作简单，不需要无菌操作，检测结果准确、灵敏、特异性强等优点，现广泛用于医学及食品检验中。在本研究中，通过rhEGF-IL-18融合蛋白和酶标抗原竞争抗rhEGF-IL-18抗体形成固相复合物，通过显色后测定OD450得到一条较稳定的标准曲线（R2=0.9898）。经过方法学评价，日内精密度和日间精密度变异系数均小于2.5%；回收率95.3%～103.0%；样品在室温放置1 h、冻融2次和冻存20 d三种条件下检测结果均较稳定；定量下限为20 ng/mL。这些均符合相关指标的要求，表明我们建立的直接竞争ELISA方法重复性好，系统稳定，可用于食蟹猴血清中rhEGF-IL-18融合蛋白的测定，为rhEGF-IL-18融合蛋白的药代动力学及后续的研究工作奠定了良好的基础。

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