李应丽，王学清，杨迎春，杨 洁

（新疆大学生命科学与技术学院，新疆乌鲁木齐830046）

葡萄为世界范围内普遍栽培的水果之一，据统计21世纪全世界年产葡萄约6.5×107t，我国年产葡萄约105t，80%～90%的葡萄用于酿酒和果汁饮料加工。葡萄籽作为两者加工的下脚料约占鲜果重量的4%～7%，这样我国每年就有4000～6000t的副产品——葡萄籽[1]。目前，国际市场上备受关注的葡萄籽提取物（GSE）是从酿酒葡萄的种子中提取出来的一种多酚混合物，其多酚含量多在95%以上[2]。原花青素是植物界广泛存在的一大类多酚化合物的总称，是由不同含量的儿茶素或表儿茶素结合而成，具有水溶、无毒、无过敏、安全性好等特性，是一种天然的自由基清除剂和抗氧化剂，具有抗衰老、抗肿瘤、抗癌变、预防心脑血管疾病、预防动脉粥样硬化等功能[3-4]。葡萄多酚主要存在于葡萄皮与葡萄籽中，研究表明，葡萄的果皮中多酚含量可达25%～50%，种籽中则可达50%～70%[5]。原花青素主要由黄烷醇中的单体儿茶素、表儿茶素、儿茶素没食子酸酯和表儿茶素没食子酸酯聚合而成。而葡萄籽中原花青素主要由儿茶素、表儿茶素、表儿茶素没食子酸酯及其二聚、三聚……最高平均聚合度达十五聚体组成[6]。通常将二-四聚体称为低聚体（OPC），将五聚体以上的称为高聚体（PPC）[7]。原花青素单体按不同聚合度形成聚合体，因构象或键合位置不同，单体又有多种异构体，要测定每一成分的含量极为困难。目前国际上还没有统一的原花青素检测方法，其定量分析常用紫外分光光度法，包括正丁醇-盐酸法、铁盐催化比色法、香草醛-盐酸／硫酸、Folin-Ciocalteau法（福林-肖卡法）及高铁盐-铁氰化钾分光光度法、钼酸铵分光光度法。此外，还可以采用高效液相色谱法及HPLC-MS联用测定原花青素含量[8]。本实验采用紫外分光光度法中的硫酸香草醛法和福林-肖卡法测定不同的葡萄籽提取物及国内和澳大利亚原花青素保健品中的原花青素含量，比较两种方法在测定结果方面的差异；并用高效液相色谱法定性分析葡萄籽提取物与市售原花青素保健品的特征峰是否一致，为同类型保健品的开发提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

葡萄籽渣 2011年10月购于中信国安葡萄酒业有限公司，发酵红葡萄酒后籽渣，葡萄品种为赤霞珠；新鲜葡萄籽 购于乌鲁木齐市场的新鲜葡萄，实验室自取葡萄籽；原花青素标准品（UV≥95%） 购自成都曼思特公司；儿茶素（HPLC≥98%）、表儿茶素（HPLC≥98%） 购自中国药品生物制品检验所；没食子酸（含量≥99%）；原花青素保健品 澳大利亚市场上购买的7种原花青素保健品，国内市场上购买的天津尖峰原花青素（原花青素含量≥95%）及安阳晶森原花青素；甲酸 色谱纯；甲醛、浓硫酸、香草醛、福林酚试剂乙等 均为国产分析纯。以上样品列表如表1。

高效液相色谱仪（LC-10ATvp） 配备紫外检测器（SPD-10Avp）和脱气装置（DGU-12A），日本岛津公司；AG204型分析天平 北京赛多利斯天平有限公司；HH-S型数显恒温水浴锅 上海精宏实验设备有限公司；Spectrumlab 53紫外可见分光光度计 上海棱光技术有限公司。

表1 葡萄籽及市售保健品编号及来源Table 1 The numbers and source of grape seeds and merchant health products

1.2 实验方法

1.2.1 样品预处理 分别称取样品PT1～PT112.0g，Y1～Y71.0g，以70%乙醇，料液比为1∶6，50℃恒温提取2h，上清液干过滤后分别定容于25mL及10mL容量瓶（PT1～PT11定容至25mL，Y1～Y7定容至10mL），避光放置待测。

1.2.2 硫酸香草醛法[9]

1.2.2.1 标准曲线的绘制 0.5mg/mL原花青素标准溶液的配制：准确称取0.025g尖峰（原花青素含量≥95%），用70%乙醇溶解并定容至50mL。配成溶液浓度分别为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/mL。分别取上述不同浓度的溶液0.5mL于10mL比色管中，然后依次加入2.5mL 30g/L香草醛和2.5mL 30%硫酸，30℃避光反应20min，于500nm下测其吸光值，以原花青素含量（mg/g）对吸光值作标准曲线。

1.2.2.2 样品中原花青素含量测定 取1.2.1中处理好的样品0.5mL于10mL比色管中，依次分别加入2.5mL 30g/L香草醛和2.5mL 30%硫酸，30℃避光反应20min，于500nm下测定吸光值，根据标准曲线计算原花青素含量（以原花青素计）。

1.2.3 福林-肖卡法[10]

1.2.3.1 标准曲线的绘制 1mg/mL没食子酸标准溶液的配制：精确称取没食子酸0.010g，用蒸馏水溶解定容至100mL。分别吸取标样溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL于10mL比色管中，依次加入0.2mol/L福林-肖卡试剂1.0mL，各管依次加入6mL左右的蒸馏水和1.5mL20%碳酸钠溶液，以蒸馏水定容至10mL。40℃显色2h，于760nm下测定吸光值，以没食子酸含量（mg/g）对吸光值作标准曲线。

1.2.3.2 样品原花青素含量测定 取1.2.1中处理的样品0.5mL于10mL比色管中，依次加入0.2mol/L福林-肖卡试剂1.0mL，各管依次加入6mL左右的蒸馏水和1.5mL20%碳酸钠溶液，以蒸馏水定容至10mL。40℃显色2h后，于760nm下测定吸光值，根据标准曲线计算原花青素含量（以没食子酸计）。

1.2.4 高效液相色谱分析[11]原花青素、儿茶素和表儿茶素标品及样品的HPLC条件：色谱柱Diamonsil C18（150mm×4.6mm，5μm），流动相为A（甲醇）和B（水），进样量25μL，柱温25℃，流速0.8mL/min，梯度洗脱：0～3min 100%A；～15min 90%A+10%B；～35min 75%A+25%B；～55min 65%A+35%B；～65min 50%A+50%B；～75min 40%A+60%B；～85min 20%A+80%B；～80min 100%B；～100min 90%A+10%B。检测波长280nm，SPD-10Avp紫外检测器。

1.3 数据处理方法

2 结果与讨论

2.1 硫酸香草醛法和福林-肖卡法测定原花青素含量对比

葡萄籽各样品中原花青素含量测定结果如图1。可看出，PT6～PT11即以新鲜葡萄籽为原料提取的原花青素含量明显高于以发酵红葡萄酒后籽渣为原料提取的原花青素，不同品种的新鲜葡萄籽中原花青素含量也有所不相同。但发酵红葡萄酒后的葡萄籽渣原料中，由于发酵后未蒸馏的PT1中含有葡萄皮，其原花青素含量低于只含有葡萄籽的PT2、PT3；且PT2、PT3中原花青素含量无显著性差异，即晒干与否对其含量影响不大，这与玫瑰香品种（即PT10、PT11）的葡萄籽结果一致。

图1 两种方法测定葡萄籽各样品中原花青素的含量Fig.1 The procyanidine content of grape seeds each sample with two assay methods

图2 两种方法测定国内外保健品中原花青素含量Fig.2 The procyanidine content of health products at home and abroad with two assay methods

图2中显示在原花青素含量以没食子酸计时，各样品之间无显著性差异，而以原花青素计时，Y6、Y7的原花青素含量远远高于其他几种样品。不论以原花青素计还是以没食子酸计，国内的尖峰与安阳和澳大利亚原花青素保健品中原花青素含量都不低于45mg/g。澳大利亚市售的7种保健品中原花青素含量为葡萄籽原料的50～100倍，但含量差别较大，其中Y6含量最高，为154mg/g。而国内的尖峰与安阳原花青素含量分别与Y2、Y3相近，并高于Y1、Y4、Y5。

图1、图2综合比较，相同样品用福林-肖卡法方法测得的原花青素含量低于用硫酸香草醛法测得的原花青素含量。但两种方法均测得Y6中原花青素含量最高。说明采用不同的方法测定原花青素含量时由于原理不同，测定的结果也不尽相同，但含量高低趋势是一致的。

2.2 高效液相色谱分析

由图3A、B、C可看出，成都曼思特原花青素标准品中含有儿茶素及表儿茶素，但是由于没有多聚体的标准品，大量组分不能确定。但可以找出特征峰，为原花青素类商品提供参考依据。图3D即为国内市场上原花青素提取物的液相图谱，因为溶液浓度不同，图中峰高不同，但安阳及尖峰原花青素与成都曼斯特原花青素标准品有较高相似度，说明二者的产品纯度较高。由图4A可看出澳大利亚原花青素保健品Y1～Y7有较多相似的峰型，与图3D中三种原花青素明显的不同是在45～55min处有一个较大的未分开的峰，其中以Y6最为明显。其中Y6样品在35min和70～80min处有较大且未分开的峰，该峰在图3D中各原花青素标准品及图4A的其他几种保健品中不存在，且Y6原花青素含量在用硫酸香草醛法及福林—肖卡法测定结果中含量均是最高的，可能与这两处峰的存在有关。图4B显示PT1（发酵红葡萄酒后未经蒸馏的红籽）的高效液相图与成都曼思特原花青素标准品的谱图最相近，且在45～55min处拥有和澳大利亚原花青素保健品相同的未分开的峰。PT5（蒸馏后酒精）在用硫酸香草醛法及福林—肖卡法测定时未检测到，但在液相图谱中可以检测到，应该与检出限不同有关。

图3 HPLC图谱Fig.3 HPLC chromatograms

图4 HPLC图谱Fig.4 HPLC chromatograms

3 结论

实验用硫酸香草醛法和福林-肖卡法对发酵红葡萄酒后的各种葡萄籽、新鲜葡萄籽及国内和澳大利亚市售的原花青素保健品进行了原花青素含量测定。对比结果显示：两种方法测得的原花青素含量不同，但各种葡萄籽样品中，新鲜晒干的葡萄籽原花青素含量高于发酵红葡萄酒后的葡萄籽；国内外市售原花青素保健品中原花青素含量约为葡萄籽的50～100倍。两种方法都测出发酵红葡萄酒后又经蒸馏白兰地的红葡萄籽（晒干及未晒干）的原花青素含量高于发酵红葡萄酒后未蒸馏的葡萄籽皮，表明葡萄籽中原花青素含量高于葡萄皮。

高效液相色谱测定结果显示国内市场上的尖峰和安阳原花青素与成都曼斯特原花青素标准品有相同的特征峰，且都含有儿茶素和表儿茶素；7种澳大利亚原花青素保健品有相似的特征峰，但与国内3种原花青素标准品在45～55min处有较大不同；实验室以发酵红葡萄酒后未经蒸馏的葡萄籽皮提取的原花青素与原花青素标准品最一致，且峰值较大，与硫酸香草醛法和福林—肖卡法的测定结果不同，这也表明HPLC在本实验中适用于定性而非定量。

对于葡萄籽中原花青素的提取，虽然新鲜葡萄籽中的含量较高，但是原料不易获得，成本较高，而作为葡萄酒厂的废料—发酵红葡萄酒后的红葡萄籽皮（或者发酵红葡萄酒后又经蒸馏白兰地的红葡萄籽），量大、易获取，且成本低，较宜作为工厂的生产原料，且将葡萄酒厂的废料进一步生加工成保健品的方法也有利于环境保护。

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