李 彬 刘 佳 李 茹 谢小华 王 颖 陈丽萍 郭 力

(河北医科大学第二医院神经内科 河北省神经病学重点实验室，石家庄050000)

多发性硬化(Multiple sclerosis，MS)是一种以中枢神经系统白质脱髓鞘病变为特点的自身免疫疾病。实验性自身免疫性脑脊髓炎(Experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)是用同种或异种中枢神经系统白质抗原或特异性T淋巴细胞诱导敏感动物发生的主要累及中枢神经系统髓鞘的自身免疫性炎症，其临床表现及病理变化和MS极其相似，是目前研究MS常用的动物模型［1］。MS的发病机制尚无定论，多数学者认为MS是遗传易感个体与环境因素作用而发生的自身免疫过程。既往研究多集中于Th1/Th2失衡对疾病的影响，然而新近研究发现，Th17/Treg平衡、IL-23/IL-17轴很可能在疾病的发生发展过程中起着更为重要的作用［2，3］。本研究通过免疫组织化学及实时定量PCR方法观察EAE小鼠脑和脊髓组织中IL-17及RORγt的动态表达情况，探讨IL-17及RORγt与EAE发生及发展的相关性。

1 材料与方法

1.1 动物分组 将45只8～10周雌性C57BL/6小鼠，体重18～20 g，随机分为对照组和EAE组。其中，对照组18只，EAE组27只。按照EAE病程发展，将EAE组分为发病前期(13天)，发病高峰期(20天)和缓解期(30天)3个亚组，每个亚组9只;空白对照组对应于EAE的亚组分组每个亚组6只。

1.2 模型制备 将抗原MOG35-55用生理盐水稀释成6 mg/ml，并按1∶1等体积加入完全弗氏佐剂(其中结核杆菌H37Ra终浓度为4 mg/ml)混合，乳化后按每只0.1 ml于小鼠脊柱两侧分四点皮下注射，免疫当天第0小时及第48小时腹腔注射500 ng PTX(百日咳毒素)。免疫当天记为0天。空白对照组18只，不作任何处理。

1.3 病情评估 采用双盲法每日早晚(8∶00和16∶00)两次对小鼠进行称重、评估，并进行神经功能评分:0分:无任何临床症状;1分:尾部张力消失，可见轻度步态笨拙;2分:双后肢无力，被动翻身后可以恢复;3分:双后肢瘫痪，被动翻身后不能恢复，但给予刺激后可以挪动;4分:双后肢瘫痪，前肢瘫痪或肌力减弱伴尿便失禁;5分:濒死状态或死亡。

症状介于两者标准之间者以±0.5计;“每日计分均值”由当日组内所有发病动物分值总和除以该组发病动物数量所得。

1.4 动物处理 在动物麻醉状态下，于发病前期、高峰期及缓解期，每个时间点EAE组取6只小鼠，对照组取3只小鼠，4%多聚甲醛灌流，取脑和脊髓腰膨大组织，进行HE染色及免疫组织化学染色。于上述3个时间点，每个时间点正常对照组及EAE组各取3只小鼠，断头处死，在无菌的环境中迅速取出脊髓组织腰膨大部位，并置于-80℃冰箱以备Real-time PCR使用。

1.5 HE染色 石蜡切片机取5 μm厚度连续切片，每间隔100 μm取1张，每个组织取3张切片进行常规HE染色。

将HE染色后的脑组织及脊髓组织切片于光学显微镜下进行观察，细胞核呈蓝色，细胞浆呈淡红色。以超过15～20个炎性细胞浸润部位记为1个炎性灶。每只小鼠取3张脑组织及脊髓组织切片，计数每张切片的炎性病灶数，累计加和后除以3为每只小鼠平均炎性病灶数。

1.6 免疫组织化学染色 将石蜡切片进行免疫组织化学染色(SP法)。一抗为兔抗小鼠IL-17多克隆抗体，二抗为生物素标记的羊抗兔IgG，滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，DAB显色，苏木素液复染，镜下观察。

每只小鼠选择脑组织及脊髓组织(相同部位)各3张组织片，每张组织片随机选取3个视野，于10×40倍光学显微镜下进行观察，并对细胞核完整的免疫组化阳性细胞进行计数。

1.7 Real-time PCR 取大约100 mg脊髓腰膨大组织，提取组织样本中总RNA，反转录成cDNA，再以合成的cDNA为模板进行PCR扩增。IL-17及RORγt引物序列见表1。根据Real-time PCR原始检测结果，按照2-△△ct相对定量计算公式，计算mRNA相对水平。

1.8 统计学分析 采用SPSS13.0统计软件进行统计分析，数值用±s表示，两组比较用t检验，单因素多组比较用方差分析。神经功能评分与炎症细胞、炎症因子间相关关系采用Pearson相关分析。P＜0.05具有统计学意义。

2 结果

2.1 EAE小鼠的发病情况及神经功能评分 EAE组小鼠免疫后出现精神萎靡、食欲减退、皮毛不光滑、体重下降。于发病前期(13天)EAE组和对照组小鼠体重的均数分别为(19.81±1.81)克、(20.99±1.55)克，两组比较EAE组小鼠体重显著减轻(P＜0.05);EAE组小鼠平均发病时间为(14.42±4.12)天。第20天发病达高峰，EAE组全部发病，发病率为100%。此期症状最严重，小鼠出现双后肢甚至四肢瘫痪及大小便失禁。EAE组的体重均数为(18.42±2.69)克，与对照组小鼠(22.87±1.99)克比较，EAE组小鼠体重明显减轻(P＜0.05)。此期EAE组的神经功能评分均数为2.38±0.52。第30天缓解期，小鼠逐渐出现体重上升，症状不同程度缓解，EAE组的体重均数为(20.87±1.43)克，与对照组小鼠(24.12±2.11)克相比，体重明显减轻(P＜0.05)，但与高峰期相比，体重有所增加(P＜0.05)。此期EAE组小鼠神经功能评分均数为1.78±0.67。

表1 IL-17及RORγt实时定量PCR引物序列Tab.1 IL-17 and RORγt oligonucleotide primers used for Real-time PCR

2.2 病理组织学观察 光镜下观察HE染色的脑组织和脊髓，可见发病前期、发病高峰期及缓解期均有炎细胞浸润，在脑组织主要集中在脑膜下及脑室周围白质;在脊髓组织主要集中在前角周围白质、灰白质交界区及正中裂血管周围，浸润细胞以淋巴细胞及中性粒细胞为主。EAE组于发病前期、高峰期、缓解期，脑及脊髓组织炎症细胞数较对照组均明显增多(P＜0.05);EAE组内，发病高峰期炎症细胞数高于发病前期及缓解期(P＜0.05)。将EAE小鼠3个时期的发病情况(以神经功能评分表示)与脑组织及脊髓组织炎症细胞浸润情况进行相关性分析，Pearson相关系数分别为0.913、0.885，且 P＜0.05，二者呈正相关。见图1、2。

图1 EAE小鼠脑及脊髓组织炎症细胞浸润情况比较Fig.1 Inflammatory foci in the brain and spinal cord of EAE mice at different stage

2.3 各组小鼠脑及脊髓组织中IL-17表达 于光镜下观察，在脑和脊髓组织中发病前期、高峰期及缓解期均有IL-17阳性细胞的表达(IL-17主要表达于胞浆中，IL-17阳性细胞表现为胞浆棕黄色颗粒，胞核由苏木精染为蓝色)。IL-17的表达部位在脑组织主要位于大脑白质及灰白质交界区的小血管周围;在脊髓组织主要位于脊膜下白质、灰白质交界区及正中裂的血管周围;表达细胞以炎症细胞为主，神经元及神经胶质细胞也有表达。EAE组3个时期与对照组相比，阳性细胞数明显增多(P＜0.05)。EAE组内，发病高峰期较发病前期及缓解期阳性细胞数明显增多(P＜0.05)。并且，从发病前期开始到发病高峰期，IL-17表达逐渐升高，进入缓解期后IL-17的表达又有下降趋势，脑及脊髓组织的上述变化与EAE小鼠的发病情况(以小鼠神经功能评分反映)进行相关性分析，Pearson相关系数分别为0.653、0.655，且 P ＜0.05，二者呈正相关。见图3、4。

2.4 各组小鼠脊髓组织中 IL-17 mRNA、RORγt mRNA水平 EAE组发病前期、发病高峰期及缓解期IL-17mRNA水平较对照组明显升高，差异具有统计学意义(P＜0.05);EAE组内，发病高峰期较发病前期及缓解期IL-17 mRNA水平明显升高，差异具有统计学意义(P＜0.05)。IL-17 mRNA的表达量与小鼠神经功能评分进行相关性分析，Pearson相关系数为0.676，且P＜0.05，二者呈正相关。见图5、6。

图2 EAE小鼠脑及脊髓组织炎症细胞浸润情况与症状评分相关性分析Fig.2 The correlation between inflammatory foci in the brain or spinal cord and neurological deficit score in EAE mice

图3 EAE小鼠脑及脊髓组织IL-17阳性细胞数比较Fig.3 IL-17 immunopositive cells in the brain and spinal cord of EAE mice at different stage

图4 EAE小鼠脑及脊髓组织IL-17阳性细胞数与症状评分相关性分析Fig.4 The correlation between IL-17 immunopositive cells in the brain or spinal cord and neurological deficit score in EAE mice

图5 EAE小鼠脊髓组织IL-17 mRNA水平的动态改变Fig.5 The dynamic expression of IL-17 mRNA in the spinal cord of EAE mice

EAE组发病前期、发病高峰期RORγt mRNA水平较对照组明显升高，差异具有统计学意义(P＜0.05)，而发病缓解期RORγt mRNA水平与对照组比较升高趋势不明显，差异无统计学意义(P＞0.05)。EAE组内，发病高峰期较发病前期及缓解期RORγt mRNA水平明显升高，差异具有统计学意义(P＜0.05)。见图7。

图6 EAE小鼠脊髓组织IL-17及RORγt mRNA水平与症状评分相关性分析Fig.6 The correlation between IL-17 or RORγt mRNA level in the spinal cord and neurological deficit score in EAE mice

图7 EAE小鼠脊髓组织 RORγt mRNA水平的动态改变Fig.7 The dynamic expression of RORγt mRNA in the spinal cord of EAE mice

3 讨论

MS的病因及发病机制尚不十分明确。随着研究的不断深入，IL-23/IL-17轴在MS发生及发展中的重要意义，开始逐渐为人们所关注。MS患者表达IL-17的外周血单核细胞数量高于健康对照组，并且临床症状加重期患者表达IL-17的单核细胞数量是缓解期患者的3.5倍;与外周血相比，MS患者脑脊液表达IL-17的单核细胞数量更多，提示MS患者IL-17表达水平增高，并且与疾病的严重程度有一定联系［4］。再者，在EAE小鼠的中枢神经系统中可检测到大量产生IL-17的CD4+T细胞浸润，将此类细胞被动转输给健康小鼠可以诱发严重的EAE，而抗 IL-17 治疗可部分缓解 EAE［5］;Komiyama 等［6］发现，IL-17基因缺陷小鼠EAE的发生明显受到抑制，表现为发病延迟且恢复更早，EAE严重程度评分和病理改变都明显减轻;而将IL-17缺失的CD4+T细胞转移到正常小鼠体内并不能诱导EAE产生，提示IL-17在MS的发生过程中具有重要作用。因此，IL-17在MS(和EAE)的发生发展过程中具有重要作用。

随着EAE的发生、发展甚至缓解，脑及脊髓组织中IL-17在蛋白及基因水平的动态改变如何，需要进一步深入探究，这也正是本实验的研究方向及内容。此外，孤儿核受体RORγt是掌管Th17细胞系分化的关键性转录因子，并且对Th17细胞分泌IL-17也起着重要作用［7-9］。因此，本研究同时测定RORγt在基因水平的动态表达，以期系统观察IL-17及其上游调控因子与EAE病程的相关性。

通过本实验发现，在HE染色中，EAE小鼠在发病前期即有炎症细胞浸润，随着症状的进展及神经功能缺损评分的增高，炎症细胞浸润程度增加，而到缓解期炎症细胞浸润较发病高峰期有下降的趋势。因此，EAE的发生及发展与炎症细胞的浸润具有密切关系。同时，印证了免疫炎症反应在EAE病程中的重要作用，为进一步研究IL-17的动态表达与EAE病程的关系奠定了基础。

免疫组化结果显示，EAE组小鼠在发病前期、发病高峰期及缓解期IL-17阳性细胞数与对照组比较均明显升高，且具有统计学意义。表明EAE的发生发展伴随不同程度的IL-17表达的增加，提示IL-17与EAE存在重要联系。而在EAE组中，EAE小鼠在发病前期IL-17表达即出现上调，早于临床症状的发生，说明早在出现临床症状之前就有IL-17相关的免疫反应发生，进一步说明了IL-17的产生对于EAE的发生具有重要作用。随免疫后时间的延长，IL-17表达呈逐渐增高趋势。随着EAE小鼠进入症状高峰期，IL-17水平亦表现出较发病前期更为明显的增加，说明IL-17的表达水平与EAE的病程发展有密切联系。而恢复期IL-17表达水平出现下降。上述动态变化经统计学相关性分析证实，IL-17表达与EAE的发生、发展及缓解呈显著正相关。

此外，IL-17 mRNA及其重要调控因子 RORγt mRNA水平动态变化趋势与免疫组化结果相一致，从基因水平证实了IL-17随EAE小鼠病情发展而动态表达及IL-17在EAE中的重要作用。在缓解期RORγt mRNA表达量与对照组无统计学差异，推测可能是由于IL-17在此期表达量较高峰期已经明显减少，而其调控因子对上述变化更加灵敏，减少的幅度较其下游调控产物IL-17更大。综合上述实验结果，表明IL-17的表达与EAE的发生、发展和缓解密切相关。

综上所述，由于IL-17的动态表达与EAE病程存在相关性，我们可以将调控IL-23/IL-17轴作为治疗MS的重要靶点，为寻找有效干预药物提供一个崭新而重要的方向和途径。

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