于秀艳 王文龙 刘晓峰 曾常茜

(吉林省肿瘤医院，长春130012)

透骨草(Phryma Leptostachya L.var.asiatica Hara)为透骨草科植物的干燥全草入药，我们的前期研究发现，透骨草提取物对人宫颈癌细胞Hela细胞具有显著的增殖抑制作用，并可诱导Hela细胞凋亡，但其相关的分子机制尚未完全清楚［1，2］。本实验采用Western blot方法观察透骨草提取物对Hela细胞PI3k、Akt、mTOR蛋白表达的影响，进一步探讨透骨草提取物诱导Hela细胞凋亡的分子机制，旨在为透骨草提取物抗宫颈癌的进一步研究和开发提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 药品、试剂及仪器 透骨草采自辽宁金州大黑山，经王心毓老先生鉴定为透骨草科植物(Phryma Leptostachya L.var.asiatica Hara);人宫颈癌 Hela 细胞购自吉林省肿瘤研究所;鼠抗人 PI3k、鼠抗人Akt、鼠抗人mTOR抗体、鼠抗人 β-actin抗体购自Cell Signaling Technology公司;RPMI1640、小牛血清和胰蛋白酶为美国Gibco公司产品;RIPA裂解液、超敏ECL化学发光试剂盒购自江苏碧云天生物技术有限公司;PVDF膜为Sigma公司产品;蛋白电转仪、垂直电泳仪、凝胶成像系统为美国Bio-Rad公司产品;DU640紫外分光光度计为美国Beckman公司产品。

1.2 透骨草提取物制备方法 加热回流提取法制备透骨草乙醇提取物:取干燥透骨草50 g，加8倍量75%乙醇，提取2小时，过滤，滤液水浴浓缩成干膏。

1.3 Hela细胞的培养和实验分组 Hela细胞用10%小牛血清的RPMI1640培养液，在37℃ 5%CO2的条件下培养，胰酶消化传代。待Hela细胞生长至对数生长期，进行实验。实验分组:透骨草提取物组加入终浓度为100 μg/ml透骨草提取物，对照组加入等体积含10%小牛血清的RPMI1640培养液。

1.4 Western blot方法检测 Hela 细胞 PI3k、Akt和mTOR蛋白表达水平 透骨草提取物组和对照组Hela细胞在37℃ 5%CO2的条件下培养48小时，分别收集透骨草提取物组和对照组的Hela细胞，PBS洗涤，加入细胞裂解液和蛋白酶抑制剂混匀，冰上裂解1小时，4℃12 000 r/min离心20分钟。收集上清，595 nm波长下用分光光度计测定样品OD值，根据OD值计算Hela细胞提取物的蛋白浓度。用细胞裂解液将透骨草提取物组和对照组蛋白稀释至等浓度，与2×上样缓冲液1∶1混合，100℃煮沸5分钟使蛋白变性。分别取透骨草提取物组和对照组蛋白60 μg，10%SDS-PAGE 凝胶电泳(80 V，30 分钟，150 V，90分钟)，转至 PVDF 膜(200 mA，4℃，1小时)。用50 g/L脱脂牛奶封闭2小时。分别加入鼠抗人 PI3k、Akt、mTOR 抗体(1∶1 000)室温孵育 2 小时，TBST洗涤3次。分别加入羊抗鼠IgG-HRP抗体(1∶5 000)室温孵育2小时，TBST洗涤3次。加入ECL试剂A和B等体积混合，1分钟后将PVDF膜蛋白面朝下与此混合液充分接触。1分钟后，将膜移至保鲜膜上，去尽残液，曝光，显影，定影。胶片用凝胶图像处理系统分析目标带的分子量和净光密度值。

2 结果

透骨草提取物对Hela细胞PI3k、Akt、mTOR蛋白水平表达的影响结果见图1:PI3k蛋白分子量为85 kD，结果可见在85 kD位置出现阳性条带，而且与对照组相比，100 μg/ml透骨草提取物作用Hela细胞后，能够下调PI3k蛋白的表达(P＜0.05);Akt蛋白分子量为60 kD，结果可见在60 kD位置出现阳性条带，而且与对照组相比，100 μg/ml透骨草提取物作用Hela细胞后，能够下调Akt蛋白的表达(P＜0.05);mTOR蛋白分子量为289 kD，结果可见在289 kD位置出现阳性条带，而且与对照组相比，100 μg/ml透骨草提取物作用Hela细胞后，能够下调mTOR蛋白的表达(P＜0.05)。上述结果表明透骨草提取物可以抑制Hela细胞PI3k、Akt和MTOR蛋白表达。

3 讨论

图1 透骨草提取物对Hela细胞PI3k、Akt、mTOR蛋白水平表达的影响Fig.1 Effect of Phryma Leptostachya L.var.asiatica Hara on the expressions of PI3k，Akt and mTOR proteins in Hela cells

越来越多的研究发现，PI3k、Akt和mTOR蛋白在宫颈癌的发生中起重要作用。磷脂酰肌醇-3羟基激酶(PI3k)是磷脂激酶家族中的重要成员，是由一个p110催化亚单位和一个p85调节亚单位组成的异源二聚体。Zhang等［3］报道宫颈癌细胞 PI3k蛋白表达显著增加。Jung等［4］研究发现8-(Tosylamino)喹啉能通过PI3k抑制宫颈癌进展。Wang等［5］研究发现一种19 kD磷蛋白 Stathmin能通过PI3k蛋白影响三氧化砷诱导的人宫颈癌细胞凋亡。Cui等［6］研究发现 MiR-125b能通过作用于 PI3kδ亚单位抑制宫颈癌细胞生长、促进宫颈癌细胞凋亡。上述研究表明PI3k蛋白与多种药物诱导宫颈癌细胞凋亡有关。本实验将100 μg/ml透骨草提取物作用于Hela细胞，首次发现透骨草提取物能够下调Hela细胞PI3k蛋白表达，表明PI3k蛋白可能与透骨草提取物诱导Hela细胞凋亡有关。

Akt是位于PI3k下游的一个重要丝苏氨酸激酶，是促进细胞生存和维持正常功能的关键信号分子。PI3k能特异性地催化磷脂酰肌醇3-位羟基磷酸化产生具有第二信使作用的磷酸化磷脂酰肌醇三磷酸(PIP3)。PIP3可与细胞内含有PH结构域的信号蛋白Akt和磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1(PDKl)结合，促使PDKl磷酸化Akt蛋白的Ser308，从而导致Akt的活化［7］。Paul等［8］报道白屈莱碱通过可以通过AKT蛋白促进人宫颈癌HeLa细胞凋亡。Zhu等［9］3，3'-二吲哚基甲烷对人宫颈癌细胞的凋亡诱导作用与AKT通路有关。Singh等［10］研究报道茶多酚诱导人宫颈癌细胞细胞凋亡与抑制Akt活化有关。Lalaoui等［11］研究发现 TRAIL-R4通过 Akt促进人宫颈癌Hela增殖，抑制Hela细胞凋亡。由此可见Akt蛋白与多种药物诱导宫颈癌细胞凋亡有关。本实验将100 μg/ml透骨草提取物作用于Hela细胞，首次发现透骨草提取物能够下调Hela细胞Akt蛋白表达，表明Akt蛋白可能与透骨草提取物诱导Hela细胞凋亡有关。

mTOR是一种不典型的丝氨酸/苏氨酸激酶，属于PIKK家族成员，分子量大小为289 kD。mTOR激活后能通过影响核糖体S6蛋白激酶和真核细胞始动因子4E结合蛋白这两个蛋白合成的关键调节因子来影响细胞的生长和分化。Akt可直接活化mTOR蛋白从而影响宫颈癌细胞的存活和增殖［12］。Li等［13］研究发现mTOR抑制剂 AZD8055能抑制宫颈癌细胞增殖。Yih等［14］研究发现抑制Akt则能促进三氧化二砷诱导的宫颈癌细胞凋亡。这些研究提示mTOR蛋白与多种药物诱导宫颈癌细胞凋亡有关。本实验将100 μg/ml透骨草提取物作用于Hela细胞，首次发现透骨草提取物能够下调Hela细胞mTOR蛋白表达，表明mTOR蛋白可能与透骨草提取物诱导Hela细胞凋亡有关。

综上，透骨草提取物诱导Hela细胞凋亡可能通过PI3k/Akt/mTOR通路起作用，这为透骨草提取物抗宫颈癌作用的研究提供了理论和实验依据。有关PI3k/Akt/mTOR信号通路的调控机制很复杂，还有待于更深入的研究。

1 曾常茜，高 松，沈 阳et al.透骨草提取物对肿瘤细胞体外增殖的影响［J］.辽宁中医杂志，2009;11(36):1952-1954.

2 于秀艳，曾常茜，高 松et al.透骨草提取物诱导人宫颈癌Hela细胞凋亡及其相关机制研究［J］.中国免疫学杂志，2012;7(7):608-610.

3 Zhang X Y，Zhang H Y，Zhang P N et al.Elevated phosphatidylinositol 3-kinase activation and its clinicopathological significance in cervical cancer［J］.Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol，2008;139(2):237-244.

4 Jung Y，Yi Y S，Yoo D S et al.8-(Tosylamino)quinoline inhibits tumour progression through targeting phosphoinositide-3-kinase/Akt pathway［J］.Pharmazie，2013;68(2):146-152.

5 Wang X，Ren J H，Lin F et al.Stathmin is involved in arsenic trioxide-induced apoptosis in human cervical cancer cell lines via PI3k linked signal pathway［J］.Cancer Biol Ther，2010;10(6):632-643.

6 Cui F，Li X，Zhu X et al.MiR-125b inhibits tumor growth and promotes apoptosis of cervical cancer cells by targeting phosphoinositide 3-kinase catalytic subunit delta［J］.Cell Physiol Biochem，2012;30(5):1310-1318.

7 Fayard E，Xue G，Parcellier A et al.Protein kinase B(PKB/Akt)，a key mediator of the PI3k signaling pathway［J］.Curr Top Microbiol Immunol，2010;346:31-56.

8 Paul A，Bishayee K，Ghosh S et al.Chelidonine isolated from ethanolic extract of Chelidonium majus promotes apoptosis in HeLa cells through p38-p53 and PI3k/AKT signalling pathways［J］.Zhong Xi Yi Jie He Xue Bao，2012;10(9):1025-1038.

9 Zhu J，Li Y，Guan C et al.Anti-proliferative and pro-apoptotic effects of 3，3 ＇-diindolylmethane in human cervical cancer cells［J］.Oncol Rep，2012;28(3):1063-1068.

10 Singh M，Singh R，Bhui K et al.Tea polyphenols induce apoptosis through mitochondrial pathway and by inhibiting nuclear factor-kappaB and Akt activation in human cervical cancer cells［J］.Oncol Res，2011;19(6):245-257.

11 Lalaoui N，Morlé A，Mérino D et al.TRAIL-R4 promotes tumor growth and resistance to apoptosis in cervical carcinoma HeLa cells through AKT［J］.PLoS One，2011;6(5):e19679.

12 Ji J，Zheng P S.Activation of mTOR signaling pathway contributes to survival of cervical cancer cells［J］.Gynecol Oncol，2010;117(1):103-108.

13 Li S，Li Y，Hu R et al.The mTOR inhibitor AZD8055 inhibits proliferation and glycolysis in cervical cancer cells［J］.Oncol Lett，2013;5(2):717-721.

14 Yih L H，Hsu N C，Wu Y C et al.Inhibition of AKT enhances mitotic cell apoptosis induced by arsenic trioxide［J］.Toxicol Appl Pharmacol，2013;267(3):228-237.