王 超 潘庆军 冯永民 刘伟敬 刘华锋

(广东医学院附属医院肾脏疾病研究所，湛江524001)

系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus，SLE)是以免疫调节失衡为特征的一种自身免疫性疾病，已有大量的研究证实，辅助性T细胞(Th细胞)功能失常在SLE发生发展中起极其重要的作用，其中Th1细胞因子功能亢进导致大量的Th1细胞因子分泌并参与了SLE的发病［1-3］。因此，深入研究SLE患者Th1细胞功能变化，对进一步明确Th1细胞在SLE发病中的作用至关重要。

自噬(Autophagy)是一种广泛存在于真核生物的生命现象，细胞通过自噬降解自身衰老或损伤的细胞器和其他大分子物质，与细胞的生长、分化、功能和存活密切相关。近期陆续有学者研究SLE患者免疫细胞自噬是否存在异常，赵继军［4］和Frédéric［5］等人发现 SLE 患者外周血单个核细胞(PBMC)自噬泡堆积。但PBMC细胞种类繁多，作为在SLE发病中起重要作用的Th1细胞，其自噬情况如何?尚未见相关文献报道。本研究通过检测SLE患者外周血Th1细胞自噬通路几种关键标记物Phospho-mTOR、Beclin-1、LC3和 p62的表达情况，借此探讨SLE患者Th1细胞自噬活性，进而初步探讨自噬异常在SLE发病过程中的作用。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2011年11月至2012年12月广东医学院附属医院肾病内科住院SLE患者68例(男13例，女55例)，诊断均符合1997年美国风湿病协会(ACR)修正的SLE分类标准。收集SLE患者的临床资料及实验室检查数据，并计算患者SLE 活动指数(SLE disease activity index，SLEDAI)，根据SLEDAI评分将SLE患者分为活动组(SLEDAI≥10分)46例(包括初诊活动期31例和复发活动期15例)和非活动组(SLEDAI＜10分)22例。活动组患者平均年龄为(24.3±7.2)岁，非活动组患者平均年龄为(30.1±9.2)岁，对照组为健康志愿者23例(男5例，女18例)，平均年龄(23.7±5.3)岁，三组之间性别、年龄差异无统计学意义(P＞0.05)。

1.2 试剂和仪器 PE-anti human IFN-γ、PE-Cy7-anti human CD3、APC-Cy7-anti human CD4 及其同型对照均购自BioLegend公司，anti human Beclin-1及其同型对照购自Abcam公司，anti human PhosphomTOR及其同型对照均购自Cell Signaling Technology公司，anti human LC3抗体及其同型对照购自MBL公司，anti human p62及其同型对照购自BD biosciences公司，FITC-anti mouse/rabbit IgG购自Santa cruz公司。裂解液、固定液、穿透液和染色液购自BioLegend和ebioscience公司。流式细胞仪为BD FACSCantoTMII。

1.3 外周血Th1细胞自噬标记物测定

1.3.1 免疫荧光标记 采集受试者清晨空腹外周静脉血3 ml，EDTA充分抗凝;取18支试管用于制备样本，先将裂解液分别加入上述各试管当中，每管3 ml，再将新鲜外周血标本150 μl分别加入上述试管当中充分裂解;离心后去上清，加入10 mmol/L PBS洗涤，加入固定液充分固定细胞;继之加入穿透液2 ml/管，洗涤穿透2次，1 500 r/min ×6分钟/次。加入穿透液100 μl/管重悬细胞后加羊血清封闭;在试管1～10 加入 0.3 μl的 PBS，11 ～14 分别加入 Beclin-1、Phospho-mTOR、LC3、p62 抗体的同型对照(量与加入相应抗体的量相同)，试管15加入Beclin-1抗体 0.3 μl，试管 16 加入 Phospho-mTOR抗体1 μl，试管17 加入 LC3 抗体0.3 μl，试管18 加入p62抗体0.3 μl，充分振荡混匀，室温避光孵育30分钟;加入PBS洗涤2次;加入穿透液100 μl/管重悬细胞后，加入相应适量二抗，避光孵育30分钟;再次洗涤2次;加入染色液100 μl/管重悬细胞，试管1未加入任何抗体，为调节各荧光通道的电压用，试管2～8加入单色抗体为调制荧光补偿用，试管9加入抗体 CD3-PE-Cy7 10 μl、CD4-APC-CY7 10 μl、Mouse IgG1，κ-PE 10 μl，试管 10 ～18 均加入抗体CD3-PE-Cy7 10 μl、CD4-APC-CY7 10 μl、IFN-γ-PE 10 μl，振荡摇匀上述各试管，避光孵育30分钟;洗涤2次后加入200 μl染色液重悬细胞;移液至流式管中，流式上机检测分析。

1.3.2 流式细胞仪检测 设置相应各通道电压和通道之间荧光补偿后，根据前向散射角和侧向散射角，对整个白细胞进行设门，以CD3+CD4+IFN-γ+定义为 Th1细胞［6］。测定 Th1细胞的 Beclin-1、Phospho-mTOR、LC3、p62的表达水平，以平均荧光强度(Mean fluorescence intensity，MFI)表示。

1.4 SLE的其他指标检测方法 补体C3采用免疫速率散射比浊法，anti-dsDNA采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测。

1.5 统计学方法 应用SPSS16.0进行数据的统计分析。根据Kolmogorov-Smimov正态性检验可知该组资料为偏态分布，本文采用非参数检测的方法对数据进行处理。计数资料差异比较采用χ2检验，计量资料采用中位数(四分位间距)［M(P25-P75)］表示，Mann-Whitney Test分析;非参数数据的相关分析采用Spearman秩相关，分别比较自噬相关标记物与SLEDAI评分及免疫学指标的相关性。以健康自愿者外周血Th1细胞Phospho-mTOR的第95百分位数和第5百分位数测量数据的上限和下限为参考值范围。敏感度=SLE活动时该指标的阳性人数/实际SLE活动人数;诊断SLE是否活动的特异度=SLE非活动时该指标的阴性人数/实际SLE非活动人数。

2 结果

2.1 各组Th1细胞自噬相关标记物的比较 SLE活动组和非活动组外周血Th1细胞Phospho-mTOR的平均荧光强度分别为1 366(1 099，1 579.2)，1 953.5(1 868.5，2 151.5)］低于对照组 2 247(2 072，2 488)，差异均有统计学意义(均 P＜0.05);SLE活动组外周血Th1细胞Phospho-mTOR的平均荧光强度低于非活动组(P＜0.05)，见图1A。

SLE活动组和非活动组的外周血Th1细胞Beclin-1 的平均荧光强度分别为［494(392.75，586.5)，529(396，566.5)］，低于对照组 655.5(522，973.5)，差异有统计学意义(P＜0.05)。但SLE活动组与非活动组相比，差异无统计学意义(P＞0.05)，见图1B。

图1 各组Th1细胞自噬相关标记物的表达情况Fig.1 The expression of autophagy markers of Th1 cells from both SLE patients and health control

SLE活动组的外周血Th1细胞LC3的平均荧光强度为 383.5(314，409)，高于非活动组 240(211.25，333.75)和对照组 254(221，299)，差异有统计学意义(P＜0.05)，而非活动组与健康对照组相比差异无统计学意义(P＞0.05)，见图1C。

SLE活动组和非活动组的外周血Th1细胞p62的平均荧光强度［分别为 172(156，181)，168.5(154.75，188.25)］与对照组 169.25(156.25，179.75)相比，差异无统计学意义(P＞0.05)，见图1D。

2.2 SLE患者Th1细胞自噬相关标记物与补体C3、SLEDAI评分和Anti-dsDNA的相关性 SLE患者组外周血Th1细胞自噬相关标记物PhosphomTOR的平均荧光强度与血清C3水平呈正相关(rs=0.458，P ＜ 0.05)，与 SLEDAI评分呈负相关(rs= －0.829，P ＜0.01)，与血清 anti-dsDNA 水平呈负相关(rs= －0.637，P ＜0.01)。而 SLE 患者组外周血Th1细胞其他自噬相关指标与血清C3水平、SLEDAI评分、血清anti-dsDNA水平均无相关关系(表1)。

2.3 SLE患者外周血Th1细胞自噬相关标记物与SLE活动度 正常人外周血Th1细胞PhosphomTOR的 MFI的中位数为 2 247，95%位数为2 791.2，5%位数为1 899.4。因此SLE患者外周血Th1细胞Phospho-mTOR的MFI低于1 899.4即为疾病活动性阳性;补体C3＜0.70 g/L为疾病活动性阳性;血清Anti-dsDNA水平以医院检验科定性指标(阳性/阴性)为准。如表2所示，在判断SLE是否活动时，SLE患者组外周血Th1细胞自噬相关标记物(Phospho-mTOR)和补体C3的敏感性显著高于血清Anti-dsDNA，但特异性相对较差。

表1 SLE患者Th1细胞自噬相关标记物与补体C3、SLEDAI评分和Anti-dsDNA的相关分析Tab.1 Correlation between the expressions of autophagy markers of Th1 cells with anti-dsDNA，C3 and SLEDAI scores

表2 Phospho-mTOR、C3和 Anti-dsDNA的变化评判SLE活动度的比较Tab.2 Comparition of changes of Phospho-mTOR，C3 and anti-dsDNA for activity of SLE

3 讨论

自噬(Autophagy)是胞浆大分子物质和衰老细胞器在膜包囊泡中降解的生物学过程，其主要功能是确保细胞在受到应激性死亡威胁时可以保持存活。目前认为自噬是一个动态连续的过程，包含自噬体的形成，自噬性底物向溶酶体的运送和在溶酶体内降解的整个过程［7］。首先，在自噬诱因(例如饥饿和氧化应激等)作用下，mTOR(mammalian target of rapamycin)磷酸化受抑制，对自噬通路启动抑制减弱，同时自噬调节蛋白Beclin-1表达升高，自噬启动;继之，ULK1复合物和PI3k(classⅢ PtdIns 3-kinase)复合物定位于 phagophore［8］，并随着 LC3(微管相关蛋白轻链3)和其他自噬相关蛋白共轭结合，双层分隔膜逐渐延伸［9］;需被清除的物质(如异常折叠蛋白质、损坏细胞器等)先与底物受体(Cargo receptor，如p62)结合，然后通过底物受体识别LC3，使底物-底物受体复合物被逐渐延伸的双层膜结构包含而形成自噬体(Autophagosome)［10］;自噬泡形成后与溶酶体结合而形成自噬溶酶体(Autolysosome)，最后在溶酶体酶的作用下，自噬泡膜和其包含物被溶酶体降解，以上过程构成一条完整的自噬通路(Autophagy pathyway)，这条自噬通路必须被精密调控，以保证各环节畅通且不过度。在自噬通路中，Phospho-mTOR和Beclin-1是自噬启动的标记，LC3II是自噬泡形成的标记，p62则是自噬泡降解的标记(图2)。

目前研究表明自噬参与了胞内抗原加工和提呈给MHCⅡ类分子，从而提高细胞的免疫监视效率，增强机体的免疫功能［11，12］，同时目前研究也表明多种自身免疫性疾病均存在自噬异常的现象［5，13，14］。然而SLE与自噬的相关研究仍在起步阶段，虽已有学者研究报道SLE患者PBMC自噬泡堆积的现象［4，5］，但由于疾病本身的复杂性，以及单个核细胞又包含多种亚型，不同亚群的细胞其自噬的变化方向(如增强、减弱)和变化水平(或幅度)也可能存在差异，仅对单个核细胞自噬泡的观察并不能真正明确SLE中的自噬失调的状况。因此，明确单一免疫细胞亚群的自噬活性显得更为重要。Th1细胞功能紊乱及其细胞因子分泌异常在SLE发病及其免疫炎性损伤中起到重要作用。在本研究中，我们旨在通过对自噬通路中四个关键自噬标记物的检测，分析SLE患者外周血Th1细胞自噬情况。

本研究发现，疾病活动期SLE患者外周血Th1细胞LC3的表达水平显著高于非活动组和正常对照组，提示SLE发病过程中存在外周血Th1细胞自噬泡堆积的现象，诱导自噬泡生成增多或抑制自噬泡的降解均可导致自噬泡的堆积，故自噬泡堆积现象并不能真正反映自噬流量的增强或减弱。而本研究发现各组之间p62的表达水平无显著性差异，提示SLE外周血Th1细胞自噬降解通路通畅。因此我们推测LC3的增多主要由诱导增强所致，即在SLE发病过程中存在外周血Th1细胞自噬流量增强的现象。已有文献证实IFN-γ等Th1细胞因子可以诱导自噬［14］，且 Dilip 等［15］研究发现，与正常对照组相比，活动组SLE患者外周血Th1细胞因子IFN-γ表达水平均显著增加，并与SLEDAI评分呈线性相关关系。这或许提示在SLE发病时增多的IFN-γ可能与Th1细胞自噬流量增强有关。

已知Phospho-mTOR活性降低说明自噬活性增强，而Beclin-1活性下降则说明自噬被抑制。本研究结果显示SLE组的Phospho-mTOR和Beclin-1的表达水平均显著低于正常对照组，以Phospho-mTOR降低更为突出，这提示SLE患者外周血Th1细胞自噬流量的增加可能主要因为mTOR磷酸化受抑制，而Beclin-1对SLE患者外周血Th1细胞自噬流量的影响可能较小;同时也提示SLE外周血Th1细胞存在着多种自噬调节蛋白的异常，至于哪些自噬调节蛋白在其中起主要作用，还需进一步探讨。

此外，我们研究结果显示SLE患者组外周血Th1细胞Phospho-mTOR的表达水平与血清补体C3呈正相关，与SLEDAI评分及Anti-dsDNA均呈负相关，这提示Th1细胞Phospho-mTOR水平与SLE疾病活动相关，可能成为评判SLE病情活动的指标之一。

最后，我们通过将Th1细胞Phospho-mTOR变化水平与传统评价指标对SLE的活动度评判上进行敏感度和特异度的初步比较，得出Th1细胞自噬相关标记物(Phospho-mTOR)和补体C3的敏感性显著高于Anti-dsDNA，但特异性相对较差的结果。当然这部分的结果仍然需要更大样本量来进行检验。

综上，本研究发现SLE患者Th1细胞中存在自噬流量增强的现象，其中Th1细胞Phospho-mTOR的表达水平与SLE疾病活动相关，有望成为SLE活动的指标之一。而SLE患者Th1细胞的自噬增强在SLE发病中的作用尚有待进一步研究。

1 Longhi M S，Ma Y，Grant C R et al.T-regs in autoimmune hepatitissystemic lupus erythematosus mixed connective tissue disease overlap syndrome are functionally defective and display a Th1 cytokine profile［J］.Autoimmun，2012;16:34-38.

2 Postal M，Pelicari K O，Sinicato N A et al.Th1/Th2 cytokine profile in childhood-onset systemic lupus erythematosus［J］.Cytokine，2013;61(3):252-256.

3 Argyrios N T，Stefanos K，Dwight H K et al.The role of IFN-γ in systemic lupus erythematosus:a challage to the Th1/Th2 paradigm in autoimmunity［J］.Athritis Res，2001;3(3):136-141.

4 赵继军，李美荣，陆才生et al.活动性系统性红斑狼疮自噬及相关基因研究［J］.中华风湿病学杂志，2009;13(3):148-151.

5 Frédéric G，Johan A，Nicolas P et al.Macroautophagy is deregulated in murine and human lupus T lymphocytes［J］.Autophagy，2012;8(7):1-11.

6 Susumu N，Yoichiro I，Hajime S et al.Phenotypic differences between Th1 and Th17 cells and negative regulation of Th1 cell differentiation by IL-17［J］.J Leurkocyte Biol，2007;8:1258-1268.

7 Kuma A，Mizushima N.Physiological role of autophagy as an intracellular recycling system:With an emphasis on nutrient metabolism［J］.Semin Cell Dev Biol，2010;21:683-690.

8 Bai X C，Jiang Y.Key factors in mTOR regulation［J］.Cell Mol Life Sci，2010;67(2):239-253.

9 Noda N N，Kumeta H，Nakatogawa H et al.Structural basis of target recognition by A tg8/LC3 during selective autophagy［J］.Genes Cells，2008;13:1211-1218.

10 Fengsmd M，Erichsen E S，Berg To et al.Ultrastructural characterization of the delimiting membranes of isolated autophagosomes and amphisomes by freeze-fracture electron microscopy［J］.Eur J Cell Biol，2000;79(12):87l-882.

11 Paludan C，Schmid D，Landthaler M et al.Endogenous MHC classⅡ processing of a viral nuclear antigen after autophagy［J］.Science，2005;307:593-596.

12 Kubaila P，Huatt A，Rioux J D et al.Impaired autophagy of intracellular pathogen induced by a Crohn’s disease associated ATGl6Ll variant［J］.PLoS One，2008;3(10):e3391.

13 Alirezaei M，Fox H S，Flynn C T et al.Elevated ATG5 expression in autoimmune demuelination and hauhiple sclerosis［J］.Autophagy，2009;5:152-158.

14 Harris J，De Haro S A，Master S S et al.T helper 2 cytokines inhibit autophagic control of intracellular Mycobacterium tuberculosis［J］.Immunity，2007;27:505-517.

15 Dilip S，Ravi K，Ajay W et al.Oxidative stress in systemic lupus erythematosus:Relationship to Th1 cytokine and disease activity［J］.Immunology Letters，2010;129:7-12.