杨慈清 李小英 付苏雷 赵善廷 林俊堂

(新乡医学院生命科学技术学院，新乡453003)

神经钙黏蛋白(N-cadherin)是一种跨模型糖蛋白，在脊椎动物中枢神经系统的表达呈明显的区域性［1］，其表达模式具有明显的时空性特点，在胚胎发育早期主要表达在细胞增殖旺盛的区域，并且在白质区的表达明显强于灰质区。N-Cadherin参与神经元迁移、神经突触形成、突触连接等功能［2，3］。神经丝蛋白(Neurofilament，NF)可以较灵敏地反映神经轴突的形态变化，是构成神经元胞体和神经轴突细胞骨架的主要成分，在维护神经元的功能和脊髓损伤修复相关的病理生理变化中发挥着重要作用，故NF作为神经骨架蛋白的指标可提示神经元生长的状态［4］。在胚胎发育过程中，N-Cadherin和 NF在中枢神经系统中的表达具有明显的相关性，前期研究结果表明在脊髓中N-Cadherin和NF表达呈时空性变化，最强表达出现在胚胎发育的E6-E8时。本研究对N-Cadherin和NF在鸡胚发育过程视顶盖中的表达模式进行研究，从而系统性的分析了NCadherin和NF在中枢神经系统中的表达模式，为进一步研究其功能提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器 新鲜种鸡蛋(当地种鸡场);一抗Rabbit anti chicken N-Cadherin单克隆抗体(Redies实验室馈赠)、Mouse anti Neurofilament(Redies实验室馈赠);二抗Goat anti rabbit Cy3标记(Molecular Probes);二抗Goat anti mouse FITC标记(Jackson ImmunoResearch);Mounting Medium with DAPI(中杉金桥);Nikon ECLIPSE 80i荧光显微镜(日本 NI-KON);CM1850冰冻切片机(德国Leica)。

1.2 方法

1.2.1 鸡胚培养 从种鸡厂购买新鲜受精鸡蛋，当天带回实验室，用温水洗净、擦干，水平放入孵化箱，温度37.8℃，湿度60%，转蛋间隔2小时，从孵育第6天(E6)开始收集胚胎，分别在E6-E20，每隔1天取材，各取3个胚胎。新鲜组织切下视顶盖，置于4%PFA(多聚甲醛)中，在保温盒冰内摇床摇晃过夜，取出组织，吸干液体，转移到18%蔗糖溶液置冰中摇晃过夜，等沉淀到管底部时取出组织吸干液体，根据组织大小，用锡箔纸做好模型，用OCT包埋，注意方向，确定冠状切面的位置，置于液氮中冷冻后放-80℃冰箱储存备用。

1.2.2 切片 从-80℃冰箱取出已包埋的组织，在冰冻切片机上连续切片，冠状切片，一次10张载玻片，每张片子根据组织大小循环贴2行，5～10列，切片后置烤片机37℃烤片30分钟以上，置-80℃冰箱保存备用。

1.2.3 荧光免疫组织化学 从-80℃低温冰箱中取出的冰冻切片40℃干燥20分钟，4%PFA中4℃固定15分钟，用1×TBS(Tris缓冲盐水:10 mmol/L的 Tris含0.9%NaCl，用1 mol/L HCl调 pH 至7.4)清洗3次，每次5分钟，在含0.1%Triton X-100的1×TBS中再孵育5分钟。每张载玻片上加1 ml免疫组化封闭液，湿盒中孵育1小时。去除封闭液后每张载玻片加300 μl经用封闭液稀释的合适浓度抗N-Cadherin(1∶500)一抗，4℃孵育过夜后，1×TBS清洗3次，每次5分钟，然后每张片加300 μl封闭液稀释的Cy3标记的针对一抗的二抗(1∶500稀释)，室温孵育1小时后，用1×TBS清洗3次，每次5分钟。然后加抗 NF(1∶100)一抗，4℃孵育过夜后，1×TBS清洗3次，每次5分钟，然后每张片加300 μl封闭液稀释的用FITC标记的针对一抗的二抗(1∶500稀释)，室温孵育1小时后，用1×TBS清洗3次，每次5分钟。最后滴加DAPI封片剂染色10分钟，加盖玻片，在荧光显微镜下观察拍照，用Photoshop CS3软件处理图片，可将3种染色同位拼合在一起，从而分析不同蛋白质的表达定位。

2 结果

2.1 神经钙黏蛋白的表达模式 鸡胚发育到E6时，通过冰冻切片，可以看到(图1C)视顶盖已经形成明显的3层结构，此时，检测N-Cadherin的表达结果显示，N-Cadherin主要在神经上皮(Neuroepithelium，NE)和新生区(Generative zone，GZ)两层呈强阳性表达。而在E8时(图1G)，视顶盖明显增厚，并且出现新的层，此时N-Cadherin除在NE层强表达外，在边沿区(marginal zone，mZ)的表达也很强。在E10时(图1K)，N-Cadherin主要分布在NE、视神经层(Presumptive stratum opticum，PSO)、前表面灰质纤维层(Presumptive stratum griseum and fibrosum superficiale，PSGFS)和亚室管膜层(Sub-ventricular zone，SVZ)。E12之后视顶盖6层的结构基本形成，只是表面灰质纤维层(Stratum griseum fibrosum superficiale，SGFS)层各亚层到E18时才能够全部形成，从图(图1N-F’)中可以看到，N-Cadherin在E12之后各层都有不同强度的表达，但相对而言，在中央灰质层(Stratum griseum central，SGC)的表达较弱，而在SGFS层的表达最强，但在SGFS层并不是均一表达，而呈现明显的层的结构，因为在SGFS层进一步可以分a-j等10个亚层，每层的细胞类型和大小都是不同的，是结构最为复杂的一层，但是，无论是在胚胎发育的早期，还是后期，N-Cadherin主要表达在细胞核密度较小的区域，这也告诉我们N-Cadherin虽然是一种跨膜性糖蛋白，但是在神经纤维中的表达量明显要高，由此，我们对神经丝蛋白的表达模式进行了同步分析。

2.2 神经丝蛋白的表达模式及其与N-Cadherin表达的异同 在E6时神经丝蛋白(Neurofilament，NF)明显的可以看到表达在GZ层(图1B)，而该层结构也是新生层，是纤维密集分布的区域;在E8时主要表达在IZ层(图1F);在E10时(图1J)，在前视神经层(Presumptive stratum opticum，PSO)的表达很强，除此，在SVZ区也有明显的表达，此时NF的表达明显的与N-Cadherin的部分表达恰好重叠(图1L)。从E12之后，NF主要表达在SAC层和SO层，与N-Cadherin只在这两层结构上重叠，在E14之后，表达强度减弱，在E20时仍然在SAC层和SO层上能够检测到其表达。为了更清楚地标记视顶盖SGFS层，用Brn2单克隆抗体标记视顶盖Ⅱ-Ⅲ层(图1H’)，从结果可以看到，Brn2是一种细胞核抗原，抗体识别并标记出SGFS和SGC两层的细胞核，但此时仍然很难清楚地分出SGFS层各亚层的结构。

图1 N-Cadherin和NF表达模式Fig.1 The patterns of N-Cadherin and neurofilament expression

3 讨论

胚胎发育早期在中枢神经系统有众多的蛋白开始表达，N-Cadherin和NF是其中两种，并且二者的表达存在相关性，N-Cadherin和NF主要分布在中枢神经系统的白质区和神经纤维密集分布的区域，并且NF的表达与神经功能的形成具有密切的关系［5］，鸡胚视顶盖是视神经密集分布的组织结构，是研究神经元迁移的理想部位，因此本研究对视顶盖中N-Cadherin和NF的表达模式进行了系统性的研究。从N-Cadherin和NF的表达模式上可以看出，二者部分区域存在共表达的模式，NF表达的区域同样有N-Cadherin的表达。如SO层，该层结构是视神经密集分布的一层，视顶盖神经传输的最为重要的一层结构，在该层二者的表达都很强，并且从结果上可以看出，二者在胚胎发育前期的表达明显高于后期，是由于在胚胎发育前期是神经元形成、成熟和迁移的重要阶段，神经元的迁移需要神经纤维的帮助，也提示N-Cadherin和NF在细胞迁移方面具有重要功能。N-Cadherin主要的功能是起到细胞之间黏着作用，除此之外，也有报道N-Cadherin参与中枢神经系统的分区、形态发生和神经纤维的投射等众多功能［6］。最新研究报道N-Cadherin是多级神经元迁移过程中的关键分子［7］，受神经元迁移关键分子的Reelin调控［8］。N-Cadherin主要影响非胶质细胞依赖性神经元的迁移，同时也对胶质细胞依赖性的神经元迁移具有调控功能［9］。为了更清楚研究N-Cadherin的功能，我们对N-Cadherin在鸡胚中枢神经系统中的表达模式进行研究，在准确掌握其表达模式的基础上研究N-Cadherin的功能。结果表明，N-Cadherin在胚胎发育早期的中枢神经系统中就有强的表达，而且具有明显的时空性，在脊髓中从胚胎发育E4开始，到E6-E8时达到高峰，而在视顶盖中的表达从能够进行切片的E6开始，就可以检测到强的表达，并且有明显的层的分布，在不同层中的表达强度各不相同。因此，从表达模式上来看，要准确研究N-Cadherin在活体内的功能，必须从胚胎发育的早期进行N-Cadherin的超异常表达。Kadowaki等［10］通过条件型基因敲除方法对NCadherin在小鼠大脑皮层形成过程的功能进行了研究，结果表明，N-Cadherin沉默后，影响小鼠大脑皮层各层细胞的正确分布，并且改变海马区的组织学结构，N-Cadherin是胚胎发育过程中非常重要的分子，实现完全敲除后会影响胚胎的发育，采用RNAi技术实现部分沉默是研究其功能的理想模式。NCadherin和NF是在胚胎发育早期开始强表达的两种分子，对其功能的研究，在活体动物体内，可以采用基因沉默的模型，相对而言对于自身高表达的蛋白如果进行基因超表达模型效果将不是很理想;另外，N-Cadherin在信号转导过程中发挥重要作用，因此，要研究N-Cadherin的功能，阐明N-Cadherin的相关调控分子及其调控机制至关重要。

致谢:感谢德国耶拿大学Redies教授在实验过程中给予Ncdh和NF抗体的馈赠和实验的指导!

1 Wöhrn J C，Nakagawa S，Ast M et al.Combinatorial expression of cadherins in the tectum and the sorting of neurites in the tectofugal pathways of the chicken embryo［J］.Neuroscience，1999;90(3):985-1000.

2 Shih W，Yamada S.N-cadherin as a key regulator of collective cell migration in a 3D environment［J］.Cell Adh Migr，2012;6(6):1-5.

3 Kadowaki M，Nakamura S，Machon O et al.N-cadherin mediates cortical organization in the mouse brain［J］.Dev Biol，2007;304(1):22-33.

4 杨慈清，石晓卫，胡阿珍.应用鸡胚活体电转GFP示踪技术观察脊髓左右两侧神经元纤维投射［J］.中国免疫学杂志，2012;28(8):718-721.

5 Yabe J T，Wang F S，Chylinski T et al.Selective accumulation of the high molecular weight neurofilament subunit within the distal region of growing axonal neurites［J］.Cell Motil Cytoskeleton，2001;50(1):1-12.

6 Redies C.Cadherins in the central nervous system［J］.Prog Neurobiol，2000;61(6):611-648.

7 Jossin Y，Cooper J A.Reelin，Rap1 and N-cadherin orient the migration of multipolar neurons in the developing neocortex［J］.Nat Neurosci，2011;14(6):697-703.

8 J Franco S J，Martinez-Garay I，Gil-Sanz C et al.Reelin regulates cadherin function via Dab1/Rap1 to control neuronal migration and lamination in the neocortex［J］.Neuron，2011;69(3):482-497.

9 Shikanai M，Nakajima K，Kawauchi T.N-cadherin regulates radial glial fiber-dependent migration of cortical locomoting neurons［J］.Commun Integr Biol，2011;4(3):326-330.

10 Kadowaki M，Nakamura S，Machon O et al.N-cadherin mediates cortical organization in the mouse brain［J］.Dev Biol，2007;304(1):22-33.