李冬梅 汪 伟 黄可欣 马洪喜

(长春大学特殊教育学院，长春130022)

近年来，糖尿病心肌病(Diabetic cardiomyopathy，DCM)已成为糖尿病并发症研究的重点与热点问题之一［1］。国内外大量的研究资料表明，大豆皂甙具有抗疲劳、抗衰老、抗炎症及抗肿瘤的作用，但其在此过程中的具体作用机制尚不明确［2，3］。前期研究发现，大豆皂甙在糖尿病的病变中有降血糖、促胰岛素分泌等作用，说明它对糖尿病的进程有一定的调控作用，从而起到治疗作用［4］。本实验通过建立糖尿病模型，监测糖尿病大鼠白细胞介素6(Interleukin-6)和肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-alpha)的水平变化，观察大豆皂甙对其的影响，研究大豆皂甙对糖尿病心肌组织的保护作用，为大豆皂甙应用于临床防治糖尿病并发症提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物、主要试剂及分组 健康雄性Wistar大鼠45只，体质量为(200±20)克由吉林省药品检验所提供(动物合格证号960101032);随机取10只动物做正常对照组，造模35只，将造模成功的30只动物随机分为糖尿病对照组(15只)、大豆皂甙给药组(15只)。大豆皂甙(SS)由吉林省中医中药研究所提供;实验用大豆皂甙用生理盐水稀释;链脲佐菌素(STZ)购于Sigma公司;IL-6和 TNF-α的ELISA检测试剂盒购于南京建成生物有限公司;IL-6和TNF-α一抗购自Santa Crus公司，二抗、三抗和DAB显色试剂盒购于福州迈新生物有限公司。

1.2 动物模型制备及给药 随机选取实验动物35只，腹腔注射STZ:STZ本身对心肌没有影响，其特性是对一定种属动物的胰岛β细胞有选择性破坏作用(用新配制的枸橼酸缓冲液溶解)50 mg/kg;48小时后采尾血测空腹血糖，浓度大于16.7 mmol/L为模型复制成功［5］。造模成功后正常对照组、糖尿病模型组和大豆皂甙给药组分别给予柠檬酸缓冲液、生理盐水和大豆皂甙(10 mg/kg)，每日灌胃，连续3个月。

1.3 标本采集 实验结束后，清晨乙醚麻醉摘取眼球取血，留血清待测;然后迅速处死取出心脏，一部分冻存用于心肌组织IL-6和TNF-α的测定，取心尖组织固定于10%中性福尔马林液中，每组取10个心脏，常规石蜡包埋，切成4微米切片2张，分别进行IL-6和TNF-α的免疫组化染色。

1.4 指标检测

1.4.1 血清及心肌组织IL-6、TNF-α 蛋白水平的检测 采用ELISA酶联免疫法检测，操作严格按照试剂盒使用说明。

1.4.2 心肌组织IL-6和TNF-α百分率的检测 采用流式细胞免疫学方法(美国BD公司产流式细胞仪)，IL-6和TNF-α的表达以阳性细胞百分率(%)表示。

1.4.3 心肌组织的病理学检测 采用HE染色法检测;光镜下观察细胞质染为粉红色，细胞核染为蓝色。

1.4.4 心肌组织IL-6和TNF-α免疫组织化学的检测 采用SP免疫组织化学染色法检测;光镜下观察见棕黄色为阳性表达，结果分析采用Motic Images Advanced 3.2图像分析系统测灰度值，灰度值越低，蛋白含量越高。

1.5 统计学分析 采用SPSS13.0软件进行统计学分析，血清及心肌组织IL-6和TNF-α的蛋白水平、心肌组织IL-6、TNF-α的百分率及免疫组织化学灰度值检测数据均以±s表示，采用t检验，检验标准 α =0.05。

2 结果

对照组大鼠体重明显增加，精神状态好，毛皮有光泽，反应灵敏。糖尿病组大鼠明显消瘦，精神萎靡，毛皮无光泽，反应迟钝。大豆皂甙治疗组大鼠体重、精神状态、毛皮光泽和反应度较对照组差，但明显好于糖尿病组。

2.1 各组血清及心肌组织IL-6、TNF-α蛋白水平的比较 模型组大鼠血清及心肌组织IL-6、TNF-α蛋白水平明显高于对照组和SS给药组有统计学意义(P＜0.01)，SS给药组略高于对照组但无显著差异(P ＞0.01);见表1。

2.2 各组心肌组织IL-6和TNF-α百分率的比较模型组大鼠心肌组织IL-6和TNF-α百分率明显高于对照组和SS给药组有统计学意义(P＜0.01)，SS给药组略高于对照组但无显著差异(P＞0.01);见表2。

2.3 各组心肌组织的病理学比较 光镜下可见对照组大鼠心肌细胞排列紧密整齐、染色均匀;糖尿病组大鼠心肌细胞排列疏散紊乱染色不均、间质可见炎细胞浸润;大豆皂甙治疗组大鼠心肌细胞基本排列整齐紧密、染色不均少见;见图1。

2.4 各组心肌组织IL-6和TNF-α免疫组织化学染色强度及灰度值的比较 免疫组化染色显示，棕黄色为阳性表达，其表达见于细胞质中;模型组大鼠心肌组织IL-6和TNF-α染色阳性强度明显高于对照组和SS给药组有统计学意义(P＜0.01)，灰度值明显低于对照组和SS给药组有统计学意义(P＜0.01);SS给药组染色强度略高于对照组但无显著差异(P＞0.01)，灰度值略低于对照组但无显著差异(P＞0.01);图像分析结果见表3，染色结果见图2、3。

表1 各组血清及心肌组织IL-6和TNF-α蛋白水平的比较(n=10，±s)Tab.1 The comparision of IL-6 and TNF-α protein levels on serum and myocardial tissue(n=10，±s)

表1 各组血清及心肌组织IL-6和TNF-α蛋白水平的比较(n=10，±s)Tab.1 The comparision of IL-6 and TNF-α protein levels on serum and myocardial tissue(n=10，±s)

Note:1)P ＜0.01，compared with control group;2)P ＞0.01，compared with control group.

Groups Serum Myocardial tissue IL-6(ng/L)TNF-α(ng/L)IL-6(ng/L)TNF-α(ng/L)Control group 0.83 ±0.16 2.13 ±0.46 0.91 ±0.232.19 ±0.34 DM group 3.24 ±0.491)5.37 ±0.651)3.63 ±0.581)6.02 ±0.711)SS group 0.91 ±0.332)2.34 ±0.512)1.03 ±0.522)2.41 ±0.732)

表2 各组心肌组织IL-6和TNF-α百分率的比较(n=10，±s)Tab.2 The comparision of IL-6 and TNF-α percentage on myocardial tissue(n=10，±s)

表2 各组心肌组织IL-6和TNF-α百分率的比较(n=10，±s)Tab.2 The comparision of IL-6 and TNF-α percentage on myocardial tissue(n=10，±s)

Note:1)P ＜0.01，compared with control group;2)P ＞0.01，compared with control group.

Groups IL-6(%) TNF-α(%)Control group 41.25 ±3.62 51.22 ±3.18 DM group 78.13 ±4.211) 82.65 ±8.221)SS group 45.11 ±5.282) 53.69 ±4.172)

表3 各组心肌组织IL-6和TNF-α灰度值的比较(n=10，±s)Tab.3 The comparision of IL-6 and TNF-α on grey value(n=10，±s)

表3 各组心肌组织IL-6和TNF-α灰度值的比较(n=10，±s)Tab.3 The comparision of IL-6 and TNF-α on grey value(n=10，±s)

Note:1)P ＜0.01，compared with control group;2)P ＞0.01，compared with control group.

Groups IL-6 TNF-α Control group 136.25 ±4.52 128.37 ±4.13 DM group 82.62 ±3.851) 80.14 ±3.851)SS group 125.34 ±4.162) 120.11 ±4.382)

图1 心肌组织中IL-6的表达(免疫组织化学染色，×400)Fig.1 IL-6 expression in myocardiac tissue(immunohistochemical staining ，×400)

图2 心肌组织中TNF-α的表达(免疫组织化学染色，×400)Fig.2 TNF-α expression in myocardiac tissue(immunohistochemical staining ，×400)

图3 心肌细胞的组织病理改变(HE染色，×400)Fig.3 Histopathological changes in myocardiac tissue(HE染色 ，×400)

3 讨论

糖尿病心肌病是指发生于糖尿病患者，不能用高血压性心脏病、冠状动脉硬化性心脏病、心脏瓣膜病及其它心脏病变来解释的心肌疾病，它是糖尿病的主要心脏并发症之一，发病率高、危害性大，与糖尿病继发心血管疾病的高发生率和高病死率密切相关［6］;它是一种特异性心肌病，病理表现为心肌肥厚和心肌纤维化，临床早期通常表现为心肌顺应性降低和舒张期充盈受阻为主的舒张功能不全，晚期以收缩功能不全为主，易发生充血性心力衰竭、心源性休克、重症患者甚至猝死［7，8］。

白细胞介素(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)都是细胞因子网络中的关键成分，参与机体炎症反应过程和能量代谢调节［9］。IL-6它可直接作用于胰岛β细胞造成其损伤，诱发胰岛素抵抗，降低胰岛素的分泌［10］。TNF-α主要由巨噬细胞产生，心脏既是TNF-α产生的主要场所，同时又是TNF-α作用的靶器官［11］，过量的 IL-6和 TNF-α作为炎症介质可介导免疫损伤及一些严重的病理生理过程。本实验室以往的研究证明，大豆皂甙在糖尿病的病变中有降血糖、促胰岛素分泌等作用，它可能是通过保护胰岛B细胞或促进受损B细胞的修复而提高血清胰岛素水平，通过促进糖原合成而增加肝糖原含量［3］。

本室前期研究证实大豆皂甙在糖尿病的病变中有降血糖、促胰岛素分泌等作用，从而对糖尿病起到治疗作用，能够延缓糖尿病心肌病的发生对心肌组织起保护作用［4］。本实验研究表明，糖尿病模型组大鼠血清及心肌组织IL-6和TNF-α蛋白水平明显高于正常组和大豆皂甙给药组(P＜0.01)、心肌组织IL-6和TNF-α的百分率明显高于正常组和大豆皂甙给药组(P＜0.01)、心肌组织IL-6和TNF-α的免疫组化阳性强度明显高于正常组和大豆皂甙给药组(P＜0.01);提示IL-6和TNF-α参与了糖尿病心肌病的发生和发展。同时本实验的心肌病理组织切片显示，模型组心肌细胞排列紊乱、肿胀而且肥大，细胞间隙增大，心肌间质可见大量炎症细胞浸润、大豆皂甙治疗组明显得到改善，心肌细胞基本排列整齐，可见少量炎细胞浸润，进一步表明对糖尿病心肌病的保护作用。综上所述，炎症因子参与了糖尿病心肌病的发生、发展过程，大豆皂甙对糖尿病继发的心肌病变具有良好保护作用，其机制可能与降低炎症因子的表达有关，为大豆皂甙进一步应用于临床糖尿病并发症的防治提供实验依据。

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