赵宏艳，王 燕，于 峥，刘梅洁，刘 红，李 艳，吕 诚，谭 勇，肖 诚，鞠大宏△

(1.中国中医科学院中医基础理论研究所，北京 100700;2.民航总医院病理科，北京 100123;3.中国中医科学院中医临床基础医学研究所，北京 100700;4.中日友好医院临床医学研究所，北京 100029)

辨证论治是中医药治病的优势所在，建立切实符合疾病发病内在本质的动物模型的制作方法，对中医学的发展具有重要意义。我们课题组对类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis，RA)肾虚证及脾虚证大鼠模型开展了大量研究［1，2］。本实验在此基础上观察益肾蠲痹丸对这两种证型RA大鼠关节肿胀程度及血浆免疫因子的影响，以期从基础研究方面对辨证论治有进一步的阐述。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 选用6周龄SPF级SD大鼠114只，由中国药品生物制品检定所提供(动物许可证号SCXK(京)2005-0004)，在中国中医科学院中医基础理论研究所清洁级动物室喂养(实验动物室许可证号SYXK(京)2005-0024)。

1.1.2 主要试剂与仪器 (1)主要试剂:牛Ⅱ型胶原(货号20022，批号100028)、不完全弗氏佐剂(货号 7002，批号 100106):美国 Chondrex公司产品;戊巴比妥钠(批号020427):北京化学试剂有限公司产品;大鼠白细胞介素(IL)-6 ELISA试剂盒(货号 BMS625，批号 49542016)、大鼠白细胞介素(IL)-10 ELISA试剂盒(货号 BMS629，批号49611006)、大鼠干扰素(IFN)-γELISA试剂盒(货号BMS621，批号 48768013):美国 Bender公司产品;利血平针剂:广东邦民制药厂;羟基脲(批号810025LC):齐鲁制药有限公司;益肾蠲痹丸:江苏正大清江制药有限公司;(2)主要仪器:T10 BASIC手持式分散机:德国IKA公司产品;Multiskan Mk3酶标仪、Wellwash 4 Mk2洗板机:美国Thermo公司;K15离心机:德国 Sigma公司产品;足趾容积测量仪:山东省医学科学院设备站产品。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及处理 适应性喂养1周后，随机分为以下10组:正常对照组10只，假手术组10只，CIA组12只，CIA治疗组12只，肾虚证(去势法)CIA组11只，肾虚证(去势法)CIA组治疗组11只，肾虚证(羟基脲法)CIA组12只，肾虚证(羟基脲法)CIA治疗组12只，脾虚证(利血平法)CIA组12只，脾虚证(利血平法)CIA治疗组12只。

CIA 组、CIA 治疗组:按前期方法进行［1，2］。去势CIA组、去势 CIA组治疗组:按常规方法［3］做去势手术，即摘除双侧卵巢，假手术组大鼠只摘除双侧卵巢附近的脂肪组织;术后28 d，去势 CIA组再按前期方法进行CIA模型复制。羟基脲CIA组、羟基脲 CIA治疗组:大鼠给予羟基脲(375 mg·kg－1·d－1)灌胃，灌胃17 d后按前期方法进行CIA模型复制。利血平 CIA组、利血平 CIA治疗组:大鼠给予利血平(0.5 mg·kg－1·d－1)腹腔注射［4］，14 d 后按前期方法进行CIA模型复制。

为保证免疫条件的齐同性，各组均在同一时间免疫。即以免疫时间为基准点，在免疫前28 d行去势手术、免疫前17 d灌服羟基脲、免疫前14 d腹腔注射利血平。II型胶原免疫18 d后，从每组筛选出10只关节炎指数≥1分大鼠，即剔除未发病的大鼠开始给药。各治疗组均灌胃给予益肾蠲痹丸(3.67 g/kg·d)，每日1次，连续4周，其余各组灌以等容积生理盐水。

1.2.2 取材 戊巴比妥钠麻醉下，采用腹主动脉取血，2500 r/min，20 min离心后取血浆，分装后－80℃冰冻备用。

1.2.3 指标的测定 (1)关节肿胀度的测量方法:致炎前在大鼠后肢踝关节上方0.5 cm处做出标记，用足趾容积测量仪测量其容积，计算出其关节肿胀度:肿胀度(edema rate，ER)=(Vt-V0)/V0×100%，其中V0表示造模前的容积，Vt表示造模后的容积;(2)血浆 IL-6、IL-10、IFN-γ 的测定:按试剂盒说明操作，根据标准品的数值计算出标准曲线，换算出样本中各因子的含量。

1.2.4 统计学处理结果用均数±标准差(珋x±s)表示，采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD法。

2 结果

2.1 益肾蠲痹丸对CIA大鼠关节肿胀程度的影响

与CIA组比较，去势CIA组及羟基脲CIA组大鼠关节肿胀度明显升高(P＜0.05);利血平 CIA大鼠关节肿胀度亦明显升高，但差异无统计学意义。与羟基脲CIA组比较，羟基脲CIA治疗组关节肿胀度明显下降(P＜0.05);与去势 CIA组比较，去势CIA治疗组关节肿胀度亦明显下降(P＜0.05);利血平CIA治疗组与利血平CIA组比较，关节肿胀度明显下降，但无统计学意义(见图1)。

2.2 益肾蠲痹丸对CIA大鼠血浆IL-6含量的影响

与正常对照组比较，各CIA组及给药组大鼠IL-6含量明显升高(P＜0.01)。与 CIA组比较，去势CIA组大鼠IL-6含量明显升高(P＜0.01)，羟基脲CIA组和利血平CIA组比较差异无统计学意义。给药组与相应模型组比较，去势CIA和羟基脲CIA大鼠治疗后IL-6含量明显下降(P＜0.01，P＜0.05)。对照CIA及利血平CIA大鼠治疗后，IL-6含量亦下降，但无统计学意义(见图2)。

2.3 益肾蠲痹丸对CIA大鼠血浆IL-10含量的影响

图1 各组大鼠关节肿胀度变化(珔x±s，n=10)注:与正常对照组比较:1)P＜0.05，2)P＜0.01;与 CIA组比较:3)P＜0.05，4)P＜0.01;与羟基脲 CIA组比较:5)P＜0.05，6)P＜0.01;与去势 CIA 组比较:7)P＜0.05，8)P ＜0.01;与利血平CIA组比较:9)P＜0.05，10)P＜0.01(下同)

图2 各组大鼠血浆 IL-6含量变化(珔x±s，n=10)

与正常对照组比较，各CIA模型组及给药组IL-10含量明显升高(P＜0.01)。与 CIA组比较，CIA治疗组、去势 CIA组、羟基脲 CIA组和利血平 CIA组IL-10含量明显升高(P＜0.05，P＜0.01)。羟基脲CIA组大鼠和去势 CIA组大鼠治疗后，IL-10含量明显升高(P＜0.01)，利血平 CIA治疗组与利血平CIA组比较，IL-10含量无显著性变化(见图3)。

图3 各组大鼠血浆 IL-10含量变化(珔x±s，n=10)

2.4 益肾蠲痹丸对 CIA大鼠血浆 IFN-γ含量的影响

与正常对照组比较，各 CIA模型组及给药组INF-γ含量明显升高(P＜0.01)。与 CIA组比较，去势CIA组 INF-γ含量明显升高(P＜0.01)，羟基脲CIA组和利血平CIA组比较差异无统计学意义。与去势CIA组比较，去势CIA治疗组IFN-γ含量明显下降(P＜0.01);与相应模型组比较，CIA治疗组、羟基脲CIA治疗组、利血平CIA治疗组IFN-γ含量明显下降(P＜0.05)(见图4)。

图4 各组大鼠血浆INF-γ含量的变化(珔x±s，n=10)

3 讨论

RA属中医学“痹病”范畴，本病的病因病机是正气亏虚，营卫不和，邪气乘虚而入，流注筋骨，搏结关节，而发为痹痛。中医专家朱良春根据多年的临床经验，认为本病病变在骨，骨为肾所主，故应益肾壮督治其本，蠲痹通络治其标，从而研制出益肾蠲痹丸。益肾蠲痹丸是治疗RA的国家三类新药，由骨碎补、淫羊藿、肉苁蓉、熟地黄、当归、全蝎、土鳖虫、僵蚕、蜈蚣、蜂房、乌梢蛇等中药组成。方中熟地黄、淫羊藿、骨碎补等补肝肾而扶正气;乌梢蛇、僵蚕、全蝎、蜂房等具有蠲痹通络、搜剔病邪的作用，诸药相合，而达到温补肾阳、益肾壮督、搜风剔邪、蠲痹通络之功效［5］。因此选用该药作为本实验补肾除痹的代表药物，从以方测证的角度观察该药对单纯痹证、肾虚痹证及脾虚痹证的疗效，从而为RA病证结合动物模型的制作提供更有力的评判依据。

我们课题组根据前期的研究，制备了肾虚证与脾虚证CIA大鼠模型。实验结果表明，各证型CIA大鼠免疫后相继出现踝关节肿胀、行动迟缓和跛行。益肾蠲痹丸可以显著减轻肾虚证CIA大鼠踝关节肿胀程度，也可以减轻对照及脾虚证CIA大鼠踝关节肿胀程度，但疗效明显低于肾虚证CIA大鼠，说明中医辨证治疗的合理性。

研究表明，在RA病人的关节液和滑膜组织中陆续检测出多种细胞因子，根据性质的不同可以分为2大组，一组为促进炎症反应的细胞因子，主要包括 IL-1、IFN-γ、IL-6、TNF-α 等;另一组为抑制炎症反应的细胞因子，如 IL-10、IL-4、TGF等。这2组细胞因子之间相互抑制产生、作用互相对抗。IL-6是一种具有活化T细胞、B细胞、巨噬细胞和破骨细胞等多种功能的细胞因子，是RA病理通路中起重要作用的细胞因子。RA滑膜中IL-6呈高表达，同时发现RA患者关节炎性渗出液中，在某些RA患者的血清中也可测得，并且IL-6的血清水平与C反应蛋白、α1-酸糖蛋白、α1抗胰蛋白酶、纤维蛋白原、亲血球蛋白以及疾病活动度和关节损伤相关等均有关［6］。在CIA模型中，不论是血清中还是在其骨髓中，内生IL-6水平也是升高的，这反映了疾病严重程度的增加［7］。IFN-γ主要由活化的 T细胞和 NK细胞产生，主要作用有活化巨噬细胞，增强MHCI、II类抗原的表达，增强NK活性，抑制纤维母细胞产生胶原，刺激并增强炎症反应，在RA的发病机制中起着不容忽视的作用［7］。IL-10是一种具有很强免疫抑制及免疫调控作用的细胞因子。几种不同的RA动物模型实验证实，IL-10具有治疗作用，能抑制CIA 模型的进展，减轻关节肿胀和软骨破坏［8，9］。

本实验结果表明，CIA组与各证型CIA组大鼠IL-6和IFN-γ水平较正常组显著升高，与以往的研究结果一致。与 CIA组比较，去势 CIA组 IL-6和IFN-γ含量明显升高，羟基脲 CIA组和利血平 CIA组差异无统计学意义。经给予益肾蠲痹丸后，大鼠血浆IL-6水平均有降低，其中去势 CIA组明显下降，CIA组、羟基脲CIA组和利血平CIA组虽含量下降，但无统计学意义;大鼠血浆IFN-γ水平亦显著降低，其中去势CIA组显著下降，羟基脲CIA组、利血平CIA组、CIA组含量亦明显下降。实验结果亦表明，CIA组大鼠及不同证型CIA组大鼠血浆中IL-10水平较正常组显著升高，且不同证型CIA组大鼠血浆中IL-10水平与CIA组大鼠相比明显升高。CIA大鼠及不同证型CIA大鼠血浆中IL-10水平的升高或可能为补偿性增加，已有相似的研究报道［10］。经益肾蠲痹丸后，各组CIA大鼠血浆IL-10水平均继续升高，但不同证型CIA大鼠IL-10升高水平不同，以肾虚组IL-10水平升高最为明显。

以上结果从血浆 IL-6、IFN-γ及 IL-10含量，反映了益肾蠲痹丸对各证型CIA大鼠异常的自身免疫反应的调节作用。结果表明，益肾蠲痹丸可下调各证型 CIA大鼠血浆中 IL-6与 IFN-γ含量，上调IL-10含量，其中肾虚证 CIA大鼠的调节作用要优于脾虚证CIA大鼠及CIA组大鼠，而去势所致肾虚CIA大鼠的疗效要略优于羟基脲所致肾虚CIA大鼠，表明去势法制作的肾虚证CIA模型更符合中医的肾虚证候动物模型，同时也进一步阐明了中医辨证治疗的合理性。

［1］ 王燕，赵宏艳，刘梅洁，等.类风湿关节炎肾虚证大鼠的建立［J］.中西医结合学报，2011，9(9):973-982.

［2］ 杜中平，赵宏艳，肖诚，等.类风湿性关节炎脾虚证病证结合动物模型的建立［J］.世界科学技术(中医药现代化)，2012，14(2):1384-1392.

［3］ 鞠大宏，于福禄，张丽坤，等.滋阴补肾法对卵巢切除所致骨质疏松大鼠成骨细胞COX-2蛋白和mRNA表达的影响［J］.中国中医基础医学杂志，2006，14:44-46.

［4］ 赵宁，贾红伟，张皖东，等.利血平所致脾虚大鼠脾阳虚证和脾气虚证的证候属性［J］.中医杂志，2008，49(5):449-452.

［5］ 张文康，朱良春.中国百年百名中医临床专家丛书［M］.北京:中国中医药出版社，2001:184-237.