富 苏，韩经丹，周 杰，范吉平△

(1.北京中医药大学东直门医院，北京 100700;2.中国中医科学院，北京 100700;3.中国中医科学院望京医院，北京 100102)

近几年，在各种脑缺血模型中均看到神经元坏死伴有凋亡发生，并认为凋亡是缺血性神经元死亡的一种形式。研究证实，缺血性脑损伤时的细胞死亡不仅存在坏死，而且会有大量细胞凋亡［1，2］。细胞凋亡成为脑缺血损伤中的研究热点，并成为开发治疗药物的治疗靶点。熊胆粉味苦性寒，归肝、胆、心、胃经，功用清热解毒。导师范吉平教授依据多年中风病治疗的临床经验发现熊胆粉对脑缺血损伤具有良好的保护作用，既往临床试验也证实以熊胆粉为君药的通络化痰胶囊可减少脑梗死病人的神经功能缺损症状［3］。本研究将试图探讨熊胆粉对脑缺血损伤大鼠神经行为学、脑组织病理学、神经细胞凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 动物

清洁级SD雄性健康成年大鼠，体质量320～350g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司(许可证号SCXK(京)2006-0009)。

1.2 药物

熊胆粉:由山东沃华医药科技股份有限公司提供;阳性对照药物尼莫地平(商品名:尼膜同):购于拜耳医药(国药准字 H20003010，生产批号BJ03850)。

1.3 主要仪器和试剂

恒温手术台(SHOR-LINE);MCAO线栓(沙东线栓);电子分析天平(Sartorius);Narrow-Alley Corner Test实验仪器(北京宽街医院);石蜡包埋机(Leica，EG1150H);石蜡切片机(Leica，RM2255);正置显微镜(Olympus BX51);光学照像生物显微镜(Leica，DMLB-HC);图像采集系统(Leica DM4000B);图像分析系统(Image-pro Plus 5.0)。

水合氯醛(国药集团化学试剂有限公司);0.9%生理盐水(石家庄四药);4%多聚甲醛(SUNBIO);超纯水(中国中医科学院医学实验中心机能实验室);乙醇、二甲苯、盐酸酒精、伊红(北京化工厂)苏木精(北京化学试剂公司);TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(武汉博士德)。

1.4 造模方法

大鼠经10%水合氯醛腹腔注射麻醉(0.35 mL·100 g－1)，大鼠麻醉成功后仰卧位固定，颈部正中切口，分离并暴露右侧颈总动脉及颈内、外动脉，颈总动脉近心端和颈内动脉搭一根尼龙线系活扣，颈外动脉近心端和远心端分别用一根尼龙线结扎，两根结扎尼龙线之间间距0.5 cm。颈总动脉动脉夹加闭后，在颈外动脉上两根结扎的尼龙线之间剪短，后将颈外动脉近心端下翻，与境内动脉成一天直线，从颈外动脉减一个小口，插入线栓，插入长度约为(20.0±0.5)mm时感到有轻微阻力时停止，在颈内动脉处扎紧尼龙线并固定线栓，并扎紧颈总动脉近心端尼龙线，取下动脉夹，缝合皮肤。术后常规护理。待实验动物清醒后，进行Zea-Longa神经功能评分，神经功能评分标准为:a.无神经功能损伤症状，动物正常活动，进食评0分;b.将动物尾巴提起后，左前肢屈曲1分;c.将动物放置平板上，向左侧转圈2分;d.将动物放置平板上，用手轻推向左侧倾倒3分;e.动物左侧偏瘫，不能自发行走意识朦胧或丧失4分。评分大于或等于2分，则表明模型成功，低于2分则予以去除。

1.3 分组和给药

造模成功的实验动物，根据神经功能评分分层随机分为5组，分别为正常对照组(蒸馏水)、假手术组(蒸馏水)、模型组(蒸馏水)、尼莫地平组(尼莫地平研碎蒸馏水溶解，按照临床用量人大鼠体表面折算给药剂量为32.4 mg·kg－1，配制成药物浓度为3.24 mg·mL－1的蒸馏水溶液)、熊胆粉组(通络化痰胶囊蒸馏水溶解，按照临床用量人大鼠体表面折算给药剂量为27 mg·kg－1，配制成药物浓度为2.7 mg·mL－1的蒸馏水溶液)。从术后第1天开始给药，以1 mL·100 g－1体重体积灌胃给药，每天 1 次，连续灌胃给药7d。

1.4 行为学测试

于术 后第 1、2、3、5、7 天进行 Narrow-Alley Corner Test行为学测试。Narrow-alley Corner Test是被国外学者广泛使用的2种神经行为学实验，主要用以检测大鼠“不对称感觉运动功能障碍”(asymmetrical sensorimotor dysfunction)［4，5］。不对称分值=(向右侧作站立转身的次数/总的站立转身的次数)×100%，正常基线为50%，分值越高，反映损伤越严重。

1.4 取材及标本制作

术后第8天每组随机取6只，10%水合氯醛深度麻醉(0.35 mL·100 g－1)，迅速打开胸腔，暴露心脏，剪开右心房，于心尖部剪开左心室，插管至主动脉，快速注入100 ml生理盐水冲洗后，再以体积分数为4%的多聚甲醛(PH值调成7.0左右)灌注固定后断头取脑。取得的脑组织入4℃4%多聚甲醛固定液中固定过夜，经过固定、脱水、透明、石蜡包埋处理，连续冠状切片，切片厚度为5μm。

1.5 HE染色和尼氏染色

上述标本行HE染色，光镜下观察缺血侧脑缺血区及其周围组织的病理学变化。

1.6 TUNEL法测细胞凋亡

组织切片，常规脱蜡，抗原修复后用 0.3%H2O2封闭内源性过氧化物酶活性，滴加TUNEL反应混合溶液，37℃避光孵育60 min，滴加转化剂，37℃孵育30 min，DAB显色、脱水、透明、封片，光学显微镜下观察。阴性对照不加TDT。首先在40倍光镜下定位缺血侧缺血半暗带额顶叶皮层，每组6只，每只动物取5张相同部位脑片，后在400倍光镜下选取5个相邻视野对阳性神经元(胞浆呈棕黄色颗粒)进行观察，采用 Image-pro Plus 5.0软件计数阳性细胞数。

1.7 统计学处理

实验数据以均数±标准差(珋x±s)表示，采用SPSS软件作统计分析，组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，P＜0.05为有统计学意义。

3 结果

3.1 熊胆粉对pMCAO大鼠神经行为学测试的影响

各组大鼠造模后缺血 1、2、3、5、7d Narrow Alley Corner Test评分结果见下表1。正常对照组和假手术组大鼠没有神经功能缺损症状，各缺血组大鼠神经缺损症状表现明显，与正常对照组和假手术组有显著统计学差异(P＜0.01)，但随着缺血时间的延长而逐渐的自行恢复，而熊胆粉组和尼莫地平组大鼠神经缺损症状的恢复速度快于模型组，与模型组有差异(P＜0.01，P ＜0.05)。

2.2 熊胆粉对pMCAO大鼠缺血侧病理学改变的影响

正常对照组和假手术组神经细胞排列有序，未见水肿，胞体、核仁、核仁清晰。模型组大鼠缺血侧坏死区范围明确，坏死区内可见间质内大小不等的空泡，其间散在着神经细胞;部分神经细胞核固缩、深染，未见核仁;部分神经细胞核溶解、胞浆疏松，细胞界限不清;大部分细胞有退形性变，神经细胞内病变较弥漫，可见深蓝色、新月样凋亡细胞。熊胆粉组和尼莫地平药组大鼠脑组织可见坏死区减小，其周边可见神经细胞、胞浆、胞核尚能分清，可见细胞带有中断，有细胞脱失，结构完整可辨的神经元数量较多，变性坏死组织范围相对较小、程度较轻。

Table 1-1 Effect of Bear bile power on the Nar row-Alley Corner Test of Rats with p MCAO(珋x±s)

Fig.1 Effect of Bear Bile Power Capsule on the morphological changes in the cerebral cor tex induced of rats with p MCAO(HE staining×400)A.normal group B.sham group C.model group D.nimodipine group E.BBP group

Fig.2 Effect of Bear Bile Power on the neuronapoptosis of ischemic penumbra of rats with p MCAO(TUNEL×400)A.normal group B.sham group C.model group D.nimodipine group E.BBP group

2.3 熊胆粉对pMCAO大鼠缺血半暗带神经细胞凋亡的影响(TUNEL法)

表2图2显示，正常对照组和假手术组未见明显凋亡细胞。模型组大鼠缺血半暗带皮层可见大量的凋亡细胞，与正常对照组和假手术组比较差异有统计学意义(P＜0.01)。凋亡细胞核被染成棕褐色，表现为细胞核固缩，胞体缩小变形、破裂成小碎片或出现凋亡小体。与模型组比较，尼莫地平和熊胆粉给药干预后其凋亡细胞数显著降低(P＜0.01)，具有明显的抑制细胞凋亡的作用。

Table 2 Effect of Bear bile power on the neuron apoptosis ofischemic penumbra of rats with p MCAO(x珋±s)

4 讨论

细胞凋亡又称程序性细胞死亡(programed cell death，PCD)，是由基因控制的细胞自主有序的死亡。MacManuS等在1993年首次报道大鼠全脑缺血与神经细胞凋亡的关系，至此之后神经细胞凋亡在脑缺血损伤中的作用日益受到关注。研究表明，神经细胞凋亡是脑缺血损伤病理作用的重要环节，是造成脑缺血损伤后继发性损害的重要机制［6，7］。脑缺血损伤既可造成细胞坏死，又可诱导细胞凋亡。细胞坏死是一个不可逆的过程，而细胞凋亡则是受一系列程序调控的过程，在脑缺血损伤后及早进行抗凋亡治疗具有重要意义［8］。

熊胆粉味苦性寒，归肝、胆、心、胃经，功用清热解毒。既往研究观察注射用熊胆粉对脑血栓、脑缺血动物模型的影响，结果注射用熊胆粉可明显抑制大鼠体内外血栓的形成，降低血液黏度，改善血液流变性，抑制血小板聚集，降低血小板黏附性，改善血栓性缺血脑组织病变程度，降低毛细血管通透性，且可降低损伤脑组织中丙二醛(MDA)水平，保护超氧化物歧化酶(SOD)活性，注射用熊胆粉对脑缺血有保护和治疗作用［9］。脑缺血损伤后的级联反应所形成的一系列神经生化毒素，导致神经功能损害，当属中医学痰、瘀、毒邪范畴，亦为应用中药抑制或阻断缺血后级联反应成为中医药治疗中风病的特色机制。本研究揭示，脑缺血损伤后早期应用熊胆粉对神经功能障碍的恢复、脑组织病理学改变有着一定的作用，其机制可能与熊胆粉可挽救缺血半暗带神经细胞凋亡有着一定的关系，然而熊胆粉减少缺血半暗带皮层神经元凋亡的机制还有待于研究进一步揭示。

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