尚晓玲，朴松兰，吕野夫

(长春中医药大学，长春 130117)

多发性硬化(multiple sclerosis，MS)是发生于中枢神经系统(CNS)由T细胞介导的慢性自身免疫性脱髓鞘疾病(experimental allergic encephalomyelities，EAE)，其复发率和病残率较高。临床实践表明，以益肾解毒通络法为主的中药复方益肾达络饮，在减轻MS临床症状、减少复发方面具有较好的疗效。为进一步探讨其治疗机理，我们进行了益肾达络饮对EAE小鼠神经损伤后的修复研究。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF级8～12周龄的SJL/J雌性小鼠40只，体质量18～20g，由美国 Jackson实验室提供，动物饲养在吉林大学实验动物中心。SJL/J小鼠在实验前清洁饮水，自由饮食。

1.2 药品与试剂

抗原 PLP139-151(HSLGKWLGHPDKF)多肽购自北京赛百盛生物工程公司，纯度85%以上;百日咳杆菌购自北京生物制品研究所;完全福氏免疫佐剂购自美国Sigma公司;MCP-1免疫组化、原位杂交试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司;醋酸泼尼松购自天津天药药业有限股份(批号1006042)，经研钵粉碎后以双蒸水溶解，充分混匀，配成0.039%浓度，4℃保存，使用前混摇均匀;益肾达络饮(由熟地、鹿角胶、栀子、石菖蒲、生甘草等组成)饮片购自长春中医药大学附属医院药房，经常规方法煎煮后制成2g生药/mL的水提物，分装灭菌后4℃保存备用;NgR、Gap-43免疫组化试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 动物模型制备

用PLP139-151制作抗原免疫小鼠:将 100μL PLP139-151 水 溶 液 (含 PLP139-151 150μg)与100μL完全福氏免疫佐剂(含结核杆菌H37RA400μg)混合，充分乳化制成油包水的抗原配剂。第1天给予SJL/J小鼠上腹部皮下注射0.2mL的抗原配剂，第1天和第3天给予静脉注射0.1 ml(含0.6×106个百日咳杆菌)百日咳杆菌液。

1.4 动物分组及给药

实验小鼠共随机分为正常组、模型组、激素组、中药组4组，每组10只。正常组不做任何处理，模型组造模后7d开始每天给予生理盐水0.2ml灌胃14d，中药组造模后7d开始每天按每公斤体重2g生药量给予益肾达络饮0.2ml灌胃14d，激素组造模后7d开始每天按每公斤体重0.078mg给予0.2ml醋酸泼尼松灌胃14d。

1.5 神经功能评价

免疫后所有动物每天称体重并进行神经功能评价，动物发病程度的判断根据Knono等提出的标准，发病后动物出现不同程度的神经功能缺损，可见动物尾部无力，尾部无力加肢体无力，肢体轻度麻痹，肢体严重麻痹，被动翻身后不能复原和濒死状态。

1.6 标本制作、切片及染色

实验小鼠在造模后22d取材。免疫组化取材用10%水合氯醛经腹腔注射麻醉小鼠，剪开胸部将灌注针由左心室穿入主动脉，依次注入0.9%生理盐水、4%多聚甲醛。经心灌注30min后，完整取出脑和脊髓固定于0.1kg/L福尔马林磷酸缓冲液中24h，石蜡包埋以备切片。取出石蜡块连续切片，片厚3μm，37℃烤干切片备用。

苏木素-伊红(HE)染色:取石蜡片、二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ各15min;下行梯度酒精各5min;自来水洗20s;Harries苏木精1min;自来水洗20s;盐酸酒精10s;自来水洗返蓝10s;伊红染色10min;自来水洗20s，85%酒精、95%酒精、100%酒精各5s;二甲苯透明各10 min;中性树胶封片，显微镜下观察。

免疫组化染色(ABC法):切片脱蜡至水，复合消化液消化，PBS漂洗。加入适当稀释的一抗(p38单抗稀释为1∶100)，4℃冰箱孵育过夜。加生物素化二抗和ABC复合物孵育各30min，显微镜下观察，DAB显色。各步骤前用0.1mol/LPBS(pH7.4)冲洗5min×3次。梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固。采用Image-Pro Plus 6.0彩色病理图文分析系统，在20倍物镜下由计算机自动算出阳性物质的积分光密度和标准差，对染色结果进行分析。

1.7 统计学方法

采用SPSS 15.0 for Windows软件处理。文中实验所测数据以均数±标准差(珋x±s)表示，进行态性检验和方差齐性检验，经 One-Way ANOVA进行方差齐性检验后，选用S-N-K进行多组比较。

2 结果

2.1 脑组织的病理形态变化

HE染色后，正常小鼠脑组织神经细胞胞核、胞质分明，组织无结构紊乱。造模后EAE小鼠出现血管周围大量炎性细胞浸润，部分神经细胞核固缩，灰质白质均受影响。炎性反应在脑室周围、小脑、脑干都有发生(图①②)。

2.2 各组小鼠脑组织 NgR、Gap-43蛋白表达情况

NgR免疫组化染色胞浆呈棕褐色的细胞为NgR阳性细胞。正常脑阳性细胞较为稀少，染色较浅。在模型组、激素组、中药组损伤区域均可见阳性细胞增多，胞体增大，胞浆深染，主要以弥漫的形式分布在灰质区域(图③-⑥)。

Gap-43免疫组化染色显示，胞浆呈棕黄色的细胞为Gap-43表达的阳性细胞。Gap-43正常组中很少表达，模型组、激素组、中药组均有表达，阳性染色物质主要沉积于神经元。模型组、激素组、中药组均有表达(图⑦-⑩)。

中枢神经系统NgR、Gap-43蛋白含量比较

结果显示，NgR表达根据多项比较组间P值可知，正常组和中药组比较差异有统计学意义(P＜0.05)，与其余组比较差异有极显著统计学意义(P值均＜0.01);模型组和激素组、中药组比较差异均有统计学意义(P值均＜0.01);激素组和中药组比较差异无统计学意义;Gap-43根据多项比较组间P值可知，正常组和模型组比较差异无统计学意义，正常组和激素组、中药组比较差异有极显著统计学意义(P值均 ＜0.01);模型组和中药组、激素组比较差异有极显著统计学意义(P值＜0.01);激素组和中药组比较差异有极显著统计学意义(P值＜0.01)。

3 讨论

EAE具有与多发性硬化(MS)相似的临床表现和病理改变，是国际公认的研究人类MS的理想动物模型。EAE发病后伴随免疫性炎症的逐渐加重，神经功能缺损的症状以及病理改变反映出神经损伤随即发生，因而控制髓鞘脱失、轴突损伤、促进神经再生已经成为本病的研究热点。CNS再生障碍是脑和脊髓永久性损伤的主要原因，神经再生抑制蛋白是阻碍神经再生的主要因素之一。目前发现的神经再生抑制蛋白有很多，其中 MAG、OMgp和 Nogo相继被分离和鉴定，它们均能通过与Nogo-A受体NgR的结合而发挥作用。Nogo-A是目前已知最强的神经轴突生长抑制因子，与特异性NgR结合［1］，从而抑制神经细胞轴突的再生并导致轴突生长锥变性萎缩的功能。本实验检测EAE小鼠CNS中NgR含量发现，其表达水平远远高出正常水平，提示 EAE发病后不仅出现神经损伤，同时表现出神经再生被抑制的情况，给予激素、中药干预的 EAE小鼠则NgR含量明显低于模型组水平，证明激素、中药都可以降低神经再生抑制蛋白表达，二者比较差异无统计学意义，均可下调Ng R表达水平，以阻止神经元修复机制进一步受损，恢复一个新的生长抑制与促进的平衡。据此表达规律，结合小鼠减轻的EAE症状分析，激素、中药都可以进行干预其表达，通过减轻神经再生抑制程度促进神经再生。

Das Sarma J实验表明，轴突损伤与患病后的肢体残疾直接相关，是影响治疗和康复的重要因素，轴突损害越重，MS的预后越差［2］。生长相关蛋白(growth associated protein-43，GAP-43)是神经组织特异性磷酸蛋白，被认为是神经元轴突生长发育和可塑性的分子标记物［3］，与神经生长密切相关。GAP-43可促进神经元的生长发育及突触的重构，在神经损伤后修复时，轴突内GAP-43的含量可增加20～100倍［4］。GAP-43高表达被认为是神经生长修复的典型特征。单靠CNS损伤后自身有限的可塑能力和损伤刺激产生的有限的GAP-43促进神经再生常常不足以完全代替神经损伤，所以一些无法修复代偿的损伤造成了后遗症。中医药在临床中治疗有神经损伤的疾病有一定疗效，尤其能改善部分神经功能缺损症状。本实验结果表明，EAE发病神经损伤后神经再生也活跃起来，模型组表达量比较低，中药益肾达络饮、激素都能促进Gap-43表达量增加，而中药复方与激素比较差异有极显著统计学意义，此实验结果与临床中通过益肾达络饮的治疗可以较好减轻神经功能缺损程度的疗效是一致的。

神经再生的障碍是由于神经生长抑制因子及胶质瘢痕屏障，很少有神经纤维跨越损伤区而进入远端，并建立功能性突触联系。如何克服抑制因子的作用和消除胶质瘢痕屏障，是今后研究的核心。在消除胶质瘢痕方面，目前还没有有效的办法。中医治疗以整体观念为指导，通过调整阴阳影响机体的多个系统，产生多层面的协调作用，此综合作用体现在降低炎性因子［5］、影响信号转导通路［6］、下调神经再生抑制蛋白表达、促进轴突再生［7］等方面，均对CNS的反应性再生、结构重建起到积极作用，这将对于CNS损伤的后期康复治疗都具有十分重要的意义。然其表现出的促进神经再生、抑制瘢痕形成的作用机制远比想象复杂得多，有待于进一步深入研究。`

［1］ Fourn ier AE，G randPre T，Strittm atter SM.Iden tif icat ion of a receptor mediating Nogo-66 inh ib ition of axonal regeneration［J］.N ature，2001，409:341.

［2］ Das Sarma J，Kenyon LC，Hingley ST，et al.Mechanisms of primary axonal damage in a viral model of multiple sclerosis［J］.J Neurosci，2009，29(49):15353-15354.

［3］ Hassiotis M，Ashwell KW，Marotte LR .et al.GAP-43 lmmunoreactivity in the brain of the developing and adult wallaby(Macropus eugenii)［J］.Anat Embryol，2002，26:97-118.

［4］ Fnlner EA.van Vliet EA，Hohmaat AJ，et al.GAP-43 mRNA and protein expression in the hippoc ampal and parahippoeampal region dm’ing the course of epileptogenesis in rats［J］.Eur J Neumsci，2003，17:2369-2380.

［5］ 尚晓玲，高颖，尹岭，等.益肾达络饮对实验性自身免疫性脑脊髓炎 MCP-1的影响［J］.天津中医药，2006，23(5):404-407.

［6］ 尚晓玲，高颖，王硕仁，等.实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠p38的变化及益肾达络饮的影响［J］.2009(3):478-480.

［7］ 尚晓玲，高颖，尹岭，等.益肾达络饮对实验性自身免疫性脑脊髓炎β淀粉样前体蛋白的影响［J］.中国中医基础医学杂志，2008，14(9):664-666.