张健民 张凡喜 黄晓龙 周玉峰

解放军第三二四医院神经外科，重庆 400020

非转移性黑色素瘤糖蛋白B（glycoprotein nonmetastatic melanoma protein B，GPNMB）是从人低转移性黑素瘤细胞中克隆得到的一种Ⅰ型跨膜糖蛋白，在多种不同组织细胞中表达，如胚胎神经系统、破骨细胞、视网膜色素上皮细胞等[1]。研究表明，GPNMB在乳腺癌、前列腺癌等多种恶性肿瘤中高表达，且与肿瘤的迁移和浸润能力呈正相关[2]。研究发现，GPNMB在胶质瘤细胞中的表达量明显高于正常胶质细胞[3-4]，且与患者的预后呈负相关性。但是，关于GPNMB对神经胶质母细胞瘤生物学特性的研究尚未见报道。因此，本研究通过RNA干扰方法抑制人胶质母细胞瘤细胞系U251和SHG44中GPNMB的表达，探讨其对细胞凋亡、增殖及侵袭能力的影响，为进一步探讨GPNMB在胶质瘤发生、发展过程中的作用奠定基础，并为以此为靶分子的胶质瘤的免疫疗法提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

人胶质母细胞瘤细胞系U251购自美国ATCC公司；人胶质母细胞瘤SHG44购自中科院上海细胞所；新生牛血清和MTT购自华美生物工程有限公司；鼠抗人GPNMB单克隆抗体购自艾美捷科技有限公司；HRP标记的羊抗鼠二抗购自南京生兴生物技术有限公司；转染试剂LipofetamineTM 2000购自Invitrogen公司；Transwell膜购自Millipore公司；AV/PI双染凋亡检测试剂盒购自BD公司。

1.2 GPNMB-siRNA

根据已知的人GPNMB编码区序列设计3对GPNMB-siRNA，其碱基序列如下，sense：5'-GGUCAGUAUUUCCAGAAAUUU-3'，anti-sense：5'-UUCCAGUCAUAAAGGUCUUUA-3'；sense：5'-CUGCCAGAUUAACAGAUAUUU-3'，antisense：5'-UUGACGGUCUAAUUGUCUAUA-3'；sense：5'-GGCUGGUUUAUCUGCUGAUUU-3'，antisense：5'-UUCCGACCAAAUAGACGACUA-3'，交由上海吉泰生物科技有限公司合成。

1.3 方法

1.3.1 GPNMB-siRNA转染 制备终浓度为80 nmol/L的siRNA-脂质体复合物，实验组加入GPNMB-siRNA混合物，同时设置空白对照组（control）和脂质体对照组（mock）。将人胶质母细胞瘤细胞系U251和SHG44分别以2×105个/孔接种于6孔板，待细胞生长至70%～80%时，更换无血清培养基，采用LipofetamineTM 2000将GPNMB-siRNA转染细胞。

1.3.2 Western blot检测GPNMB的沉默效果 将培养的细胞用0.05%胰蛋白酶消化，PBS洗涤3次；加入450 μL细胞裂解液裂解细胞，SDS-PAGE蛋白电泳；电泳结束后将蛋白转移到硝酸纤维素膜上，用5%脱脂奶粉封闭，按照常规的方法加入鼠抗人GPNMB单克隆抗体、HRP标记的羊抗鼠二抗，Western blot分析GPNMB的沉默效果。

1.3.3 Annexin V/PI检测细胞凋亡 按操作说明书进行凋亡实验，具体操作为：收集各组细胞，用预冷的PBS洗涤3次，加入1 mL 1×Annexin V结合缓冲液，离心去上清，再加入200 μL结合缓冲液重悬细胞，分别加入10 μL Annexin V-FITC 和 5 μL PI（5 μg/mL），轻轻混匀，避光孵育 30 min，流式细胞仪检测。

1.3.4 MTT法检测细胞增殖能力 取对数期生长的U251和SHG44细胞接种于96孔板，每孔200 μL，含2×104个细胞，加入GPNMB-siRNA培养48 h，设置空白对照组；每孔加入 20 μL MTT 溶液（5 mg/mL），继续培养 4 h；弃上清，加入150 μL二甲基亚砜，摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解；酶标仪上测定570 nm处OD值。

1.3.5 Transwell检测细胞侵袭能力 将培养的人胶质母细胞瘤U251和SHG44细胞消化成单细胞悬液，无血清培养基洗3次，将细胞悬液密度调整成2×105个/mL备用。预先将Matrigel（提前12 h）用无血清培养基DMEM稀释成1∶3浓度，均匀地铺满Transwell小室上室的聚碳酸酯膜，室温放置1 h，使Matrigel凝固形成基质膜。Transwell下腔室加入700 μL含10%胎牛血清的DMEM培养基，小室内接种200 μL无血清细胞悬液，培养18 h后取出Transwell膜，预冷的PBS洗涤2次，4%多聚甲醛固定15 min，0.1%结晶紫染色5～10 min，显微镜下拍照，统计穿过Transwell膜的细胞数。实验重复3次。

1.4 统计学方法

采用SPSS 13.0统计软件进行统计学分析。计量资料数据以均数±标准差（±s）表示，采用t检验及单因素方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 GPNMB基因敲除效果

提取转染siRNA细胞总蛋白，Western blot结果证实，与空白对照组和脂质体对照组相比，GPNMB-siRNA转染组中GPNMB的表达量明显下降（P＜0.05）。siRNA转染的U251细胞中GPNMB表达量仅为18.97%，SHG44细胞中GPNMB的表达量仅为25.68%，表明GPNMB-siRNA转染能特异性沉默U251和SHG44细胞中GPNMB的表达（图1）。

2.2 GPNMB-siRNA对U251和SHG44细胞凋亡的影响

转染48 h后，Annexin V/PI染色，流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果显示，与空白对照组相比，GPNMB基因沉默对U251（图2A）和SHG44细胞的凋亡无显著影响（图2B），表明GPNMB不参与调控人胶质母细胞瘤U251和SHG44细胞的凋亡。

2.3 GPNMB-siRNA对U251和SHG44细胞增殖能力的影响

MTT法检测细胞生长曲线，以培养时间为横轴和平均OD值为纵轴绘制生长曲线（图3）。结果显示，与空白对照组相比，GPNMB-siRNA转染后U251和SHG44细胞的生长速度明显减缓，差异有统计学意义（P＜0.05），表明GPNMB沉默可显著影响人胶质母细胞瘤U251和SHG44细胞的增殖能力。

2.4 GPNMB-siRNA对U251和SHG44细胞侵袭能力的影响

Transwell侵袭试验结果显示，GPNMB-siRNA转染的U251和SHG44细胞侵出小室的数目分别为（70.0±4.6）个和（43.0±6.6）个。与空白对照组相比，转染组细胞的侵出小室数目明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05），表明GPNMB的缺失可明显抑制人胶质母细胞瘤细胞的侵袭能力（图 4）。

3 讨论

神经胶质母细胞瘤是中枢神经系统最为常见的原发性肿瘤，约占脑瘤发病率的50%，是脑癌中死亡率最高和最常见的一种，具有生长速度快和侵袭力强等特性[5]。尽管近年来治疗手段不断进步，但较高的侵袭性使胶质瘤治疗效果并不是很理想，一般发病后患者的平均寿命仅14个月[6]。随着分子生物学及免疫学等的发展，许多与肿瘤生物学特性相关的分子显示出良好的应用前景[7-8]。因此，对与肿瘤生物学功能相关分子的研究具有重大意义。

GPNMB是一种典型的Ⅰ型跨膜糖蛋白，表达于多种组织中，参与细胞多种生理功能，如细胞的分化、炎症、组织重建及肿瘤发育等[3]。研究表明，正常人脑组织中GPNMB不表达或者少量表达，而脑瘤患者中GPNMB大量表达，是正常人的10倍以上[9]。此外，GPNMB在多种恶性肿瘤中均表达，胶质母细胞瘤患者活体检测分析表明，GPNMB与患者的预后分析呈负相关性，提示GPNMB具有作为肿瘤前期诊断及预后分析指标的潜能[4]。但是，关于GPNMB在胶质母细胞瘤发生、发展过程中的作用值得进一步探讨。

本研究通过RNA干扰法探讨了GPNMB对胶质母细胞瘤细胞系生物学特性的影响，结果证实，GPNMB缺失对U251及SHG44细胞凋亡无显著影响，但细胞的增殖能力和侵袭能力被显著抑制，表明GPNMB参与调控人胶质母细胞瘤细胞的增殖及侵袭，提示GPNMB在胶质母细胞瘤的发生和发展中可能发挥着重要作用。此外，由于GPNMB能够抑制胶质母细胞瘤细胞的增殖及侵袭，有望成为胶质母细胞瘤治疗的潜在靶分子。虽然本研究证实了GPNMB在神经胶质母细胞瘤中发挥着重要作用，但是确切的信号途径尚不清楚，有待于进一步探讨。

[1]Owen TA，Smock SL，Prakash S，et al.Identification and characterization of the genes encoding human and mouse osteoactivin [J].Crit Rev Eukaryot Gene Expr，2003，13（2-4）：205-220.

[2]Rose AN，Grosset AA，Dong Z，et al.Glycoprotein nonmetastatic B is an independent prognostic indicator of recurrence and a novel therapeutic target in breast cancer[J].Clin Cancer Res，2010，16（7）：2147-2156.

[3]Huang JJ，Ma WJ，Yokoyama S.Expression and immunolocalization of Gpnmb，a glioma-associated glycoprotein，in normal and inflamed central nervous systems of adult rats[J].Brain and Behav，2012，2（2）：85-96.

[4]Kuan CT，Wakiya K，Dowell JM，et al.Glycoprotein nonmetastatic mela noma protein B，a potential molecular therapeutic target in patients with glioblastoma multiforme[J].Clin Cancer Res，2006，12（7 Pt 1）：197-1982.

[5]Berger M，Leibel S，Bruner J，et al.Primary central nervous system tumors of the supratentorial compartment.Cancer in the nervous system[M].New York：Churchill Livingstone，1996：57-126.

[6]McLendon RE，Halperin EC.Is the long-term survival of patients with intracranial glioblastoma multiforme overstated? [J].Cancer，2003，98（8）：1745-1748.

[7]Naumovski L，Junutula JR.Glembatumumab vedotin，a conjugate of an anti-glycoprotein non-metastatic melanoma protein B mAb and monomethyl auristatin E for the treatment of melanoma and breast cancer[J].Curr Opin Mol Ther，2010，12（2）：248-257.

[8]Bao S，Wu Q，Li Z，et al.Targeting cancer stem cells through L1CAM suppresses glioma growth[J].Cancer Res，2008，68（15）：6043-6048.

[9]Loging WT，Lal A，Siu IM，et al.Identifying potential tumor markers and antigens by database mining and rapid expression screening[J].Genome Res，2000，10（9）：1393-1402.