王 鹏 周立社 贾彦彬

包头医学院第一附属医院检验科，内蒙古包头 014010

维生素D（Vitamin D）是人体一种必需的维生素，人体不能自行合成，需通过日晒或食物摄入获得。维生素D本身无活性，需要在体内经过两次羟化，转化为1，25-二羟维生素 D3[1，25-（OH）2D3]才能发挥强大的生物效应[1]。VDR与1，25-（OH）2D3结合后，该复合物可与靶基因上游启动子区或调控区域上的特定DNA序列相结合，进而对靶基因的转录表达进行调控。VDR基因多态性分别对应多个内切酶酶切位点，目前已发现VDR基因含有5个限制性内切酶片段长度多态性（RFLP），分别是BsmI、ApaI、TaqI、FokI、Tru9I的酶切位点。 Tru9I多态性位点是 2000 年法国Ye等[2]首次发现并报道的，它位于VDR第Ⅷ内含子末端，发生G/A改变的多态性位点。Tru9I多态性位点虽然不改变VDR的蛋白序列，但转录出VDR基因的mRNA 3′末端区域可以影响mRNA的表达和稳定性，影响增强子对靶部位的亲和力。国外研究认为Tru9I多态性与1型糖尿病[3]、直结肠腺癌等疾病及骨密度[4]相关。本文对VDR单核苷酸多态性位点的研究，旨在了解本地区健康人群VDR基因Tru9I多态性分布特点，为更好地研究维生素D受体基因单核苷酸多态性与疾病的关系提供有价值的参考数据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

样本来自包头医学院第一附属医院2009年1月～2011年12月的汉族健康体检者，经本人同意且在包头市居住5年以上的人群为对象，从中选择400人，男200人，女200人，年龄20～65岁，均排除有严重器质性疾病、高血压、糖尿病、内分泌疾病、恶性肿瘤史者以及严重肝、胆、肾疾病等疾病者。

1.2 仪器和试剂

人外周血基因组DNA提取试剂盒，2×Taq PCR MasterMix（含染料），DNA Marker均为北京天根生化科技有限公司产品；琼脂糖购自北京赛百盛生物工程公司；溴化乙锭（EB）、TAE缓冲液等试剂购于杭州博日公司；限制性内切酶 Tru9I由纽英伦生物技术（北京）有限公司提供，浓度为10 000 U/mL；芬兰进口雷勃加样器；日本三洋超低温冰箱；LX-200型迷你离心机为海门市其林贝尔仪器制造有限公司生产。

1.3 方法

1.3.1 样本采集 用EDTA抗凝管经无菌操作抽取体检者外周血3 mL，于-80℃保存备用。

1.3.2 DNA提取 严格按照DNA提取试剂盒说明操作，此试剂盒采用可特异性结合DNA的离心吸附柱和特殊的缓冲系统，能高效提取血液中的基因组DNA。

1.3.3 PCR扩增 引物参照同类研究[5]：上游引物：5′-GGC AACCTGAAGGGAGACGTA-3′； 下游引物：5′-CTCTTTGGACCTCATCACCGAC-3′，反应的总体积 25 μL，含模板DNA 1.5 μL，两端引物各 1 μL，2×Taq Master Mix 12.5 μL，ddH2O 9 μL。 PCR 反应条件：94℃预变性 5 min；然后 94℃变性 45 s，57℃退火 45 s，72℃延伸 45 s，35 个循环，最后72℃延伸10 min。取5 μL PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，然后应用凝胶成像分析系统分析，确认PCR反应产物。VDR-Tru9I基因应扩增出461 bp的目的条带。

1.3.4 PCR扩增产物的限制性酶切 以上得到的扩增产物用限制性内切酶Tru9I酶切。取PCR扩增产物6 μL，加入1 μL 限制性内切酶Tru9I（10 000 U/mL）及相应的缓冲液，37℃水浴4 h。取5 μL酶切产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像分析系统成像酶切产物。根据片段大小进行基因型分析。分型标准为TT基因型：461 bp一个片段；Tt基因型：461 bp、361 bp、100 bp 三个片段；t基因型：361 bp、100 bp两个片段。

1.4 统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件对数据进行统计分析，χ2检验判断Tru9I的基因型分布是否符合Hardy-Weinberg平衡定律。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PCR产物酶切结果

经限制性内切酶Tru9I对PCR产物消化后电泳发现VDR基因存在多态性。VDR基因有两个等位基因T和t，可组合形成 TT、Tt、tt 3 种基因型（图1）。

2.2 包头地区汉族健康人群VDR-Tru9I基因型与等位基因的频率分布

见表1。

表1 包头地区汉族健康人群VDR-Tru9I基因型与等位基因的分布频率

2.3 Hardy-Weinberg遗传平衡检验

为考察资料的可靠性，进行VDR基因型分布的遗传平衡检验，结果基因型频率分布符合Hardy-Weinberg平衡定律（P＞0.05），本研究人群具有群体代表性。

3 讨论

VDR在体内的生物学作用主要是介导Vit D的效应细胞作用，VDR基因多态性与骨质疏松的形成关系密切。Tru9I多态性位点位于第Ⅷ内含子末端，发生了G/A改变，可影响mRNA水平和稳定性，是一个功能性的SNP。相对于其他维生素D基因多态性位点，国内外对其的研究较少。虽然最近国内张丽娅等[5]对Tru9I进行了研究，但其样本局限于男性。本研究检测了包头地区400名汉族健康人群的VDR基因Tru9I多态性位点基因型和等位基因频率分布情况，结果显示 TT、Tt、tt三种基因型频率分别为44%、38%、18%。T等位基因占63%，t等位基因占37%。此结果与国外的报道有一定的差异[3，6]，而与国内陈为坚等[7]报道的大致接近。这可能由于东西方人群差异所造成，因此推论VDR基因Tru9I多态性的分布可能存在种族差异，且环境因素也可能会造成同一种族的基因频率发生微小的变化。基因多态性的碱基的取代、缺失、插入而引起编码序列的核苷酸顺序改变，在转录和翻译合成蛋白质的过程中，造成遗传密码的改变、mRNA剪接异常、蛋白质肽链中的片段缺失、或启动子的突变及非转录区的突变等。有的可以使基因的转录水平或活性增强或降低，并且对多肽链中氨基酸的排列顺序产生影响。基因多态性的研究对于遗传病是具有双重意义的，首先，基因的有害突变，包括经典的点突变和已知的动态突变，都有可能成为生物体发病的根源，导致遗传病的发生和发展；其次，基因多态性位点众多，是很好的遗传标记，可以在遗传病的研究和临床诊断中发挥重要的作用。

随着人类基因组计划的迅猛进展，研究基因组中的序列改变也就是人类DNA多态性成为必然，同时医学界就此也达成共识，即不论是器质性的疾病还是功能性的疾病，无论是躯体性的还是精神心理性的疾病，都有必要从基因水平上去探究其病因，以此为基础设计出新的治疗方案，研究新的药物。这些研究为群体遗传学、药物的开发、法医学、遗传疾病的进一步研究提供了巨大的推动力。

[1]Brazier M，Kamel S，Maamer M，et al.Markers of bone remodeling in the elderly subject：effects of vitamin D insufficiency and its correction[J].J Bone Miner Res，1995，10（11）：1753-1758.

[2]Ye WZ，Reis A，Velho G.Identification of a novel Tru9I polymorphism in the human vitamin D receptor gene[J].J Hum Genet，2000，45：56.

[3]Vesna B，Veselin SK，Eleftheria Z，et al.Family-based analysis of vitamin D receptor gene polymor phisms and type 1 diabetes in the population of South Croatia[J].J Hum Genet，2008，53（3）：210.

[4]Zajickova KK，Hill M，Vankova M，et al.Low-density lipoprotein receptor-related protein 5 and vitamin D receptor gene polymorphisms in relation to vitamin D levels in menopause[J].Clinical Chemistry and Laboratory Medicine，2006，44（9）：1066.

[5]张丽娅，白玉蓉，韩昕，等.北京地区部分汉族男性维生素D受体基因Tru9I多态性与骨密度的关系[J].北京师范大学学报：自然科学版，2010，46（4）：485.

[6]Zajickova K，Krepelova A，Zofkova I.Single nucleotide polymorphism under the reverse primer binding site may lead to bsmI Mis-Genotyping in the Vitamin D receptor[J].Gene J Bone Mineral Res，2003，18：1754.

[7]陈为坚，叶伟，苏培强，等.汉族人维生素D受体基因TruⅠ酶切位点多态性及其对BsmⅠ酶切位点多态性测定的影响[J].中华医学遗传学杂志，2007，24（3）：338.