赵丽波 张健莉 付宏娟 黄月萍

黑龙江省医院老年神经内科，黑龙江哈尔滨 150036

多发性硬化（mulitple sclerosis，MS）是一种以中枢神经系统白质脱髓鞘为主要病理特点的自身免疫性疾病，MS产生的免疫反应多认为是自身免疫细胞被激活后对髓鞘碱性蛋白（MBP）的免疫反应[1]。MBP是构成中枢神经系统髓鞘的一种特殊蛋白质，在髓鞘形成和脑分化发育过程中起着重要作用[2]。MS患者体内中枢神经系统的自身抗原-MBP暴露与免疫活性细胞相互作用诱导了特异的免疫应答，导致炎性髓鞘病理性脱失，游离的MBP就会进入血液中导致血液中含量升高[3]。目前临床对MS进行脑脊液免疫学检查项目较多，但尚无一满意的特异性检查，因此，临床一般将周围血和脑脊液同时进行检查[4]。本研究旨在通过观察利用MBP作为抗原，复制MS的动物模型实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）豚鼠周围血和脑脊液MBP、血清白介素 12（IL-12）干扰素 γ（IFN-γ）的水平，并动态观察应用他克莫司治疗前及治疗后不同时间MBP、IL-12、IFN-γ的变化情况，从而可能为预防MS临床复发提供一种有效的新药提供指导。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

大鼠 IL-12、IFN-γ、MBP（ELISA）试剂盒（美国 R&D公司）；BIO-RAD 550型酶标仪（美国BIO-RA D公司）。

1.2 实验动物及方法

豚鼠22只，雌雄各半，7～8周龄，体重 200～250 g，利用MBP作为抗原，复制MS的动物模型EAE，在每只大鼠的双侧后足跖一次性皮下注射含有豚鼠MBP 25 μg的弗氏完全佐剂（FCA）200 μL，模型制备成功的表现为急性、严重的单向病程，可自发缓解。将试验动物随机分为研究组（12只）和对照组（10只），对照组予以 EAE+生理盐水，研究组在EAE诱导的第1～7天，每日腹腔内注射剂量为1 mg/kg的他克莫司，其中急性发作期8只，缓解期4只。

1.3 检测方法

大鼠心室内取血0.6 mL，静置20 min，3 000 r/min离心 20 min，取血清-20℃冻存，备测 IL-12、IFN-γ、MBP 用。IL-12、IFN-γ、MBP 检测采用双抗体夹心法（ELISA）测定，操作方法严格按使用说明书进行。

1.4 统计学方法

数据采用SPSS 13.0进行统计学处理，计量资料采用均数±标准差（±s）表示，组间比较采用 t检验，以 P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组血清和脑脊液中MBP水平比较

研究组大鼠血清和脑脊液中的MBP水平均显著高于对照组，差异有高度统计学意义（P＜0.01）。且两组脑脊液中的MBP水平均显著高于血清中MBP水平，差异有高度统计学意义（P＜0.01）。见表1。

表1 两组血清和脑脊液中MBP水平比较（±s）

表1 两组血清和脑脊液中MBP水平比较（±s）

注：与血清MBP比较，#P＜0.01

组别 只数 MBP水平血清（ng/mL） 脑脊液（ng/mL）研究组对照组t值P值12 10 7.62±1.74 1.52±0.83 3.946＜0.01 12.07±3.42#4.39±1.35#5.284＜0.01

2.2 大鼠急性发作期及缓解期血清及脑脊液MBP水平及血清IL-12、IFN-γ水平比较

研究组MS大鼠急性发作期及缓解期血清及脑脊液中MBP、IL-12、IFN-γ水平均明显高于对照组，差异有高度统计学意义（P＜0.01），且MS急性发作期血清及脑脊液中MBP、IL-12、IFN-γ水平均分别显著高于MS缓解期，差异有高度统计学意义（P＜0.01），且MS大鼠其脑脊液 MBP和血清MBP水平呈正相关（r=0.562，P＜0.01）。见表2。

表2 MS大鼠急性发作期及缓解期血清及脑脊液MBP水平及血清 IL-12、IFN-γ 水平比较（±s）

表2 MS大鼠急性发作期及缓解期血清及脑脊液MBP水平及血清 IL-12、IFN-γ 水平比较（±s）

注：与对照组比较，*P＜0.01；与缓解期比较，#P＜0.01

组别 只数MBP水平血清（ng/mL）脑脊液（ng/mL）IL-12（pg/mL）IFN-γ（ng/mL）急性发作期组缓解期组对照组841 0 10.86±1.59*#5.35±1.14*1.52±0.83 17.45±2.82*#8.23±1.44*4.39±1.35 32.60±10.52*#22.50±6.42*16.63±3.13 15.65±3.35*#6.05±2.28*3.01±1.15

2.3 研究组大鼠治疗前及治疗后的不同时间血清和脑脊液MBP水平及血清IL-12、IFN-γ水平比较的变化情况比较

12只大鼠予以他克莫司注射后，结果显示，治疗后的第3天及治疗后第7天血清和脑脊液MBP、IL-12、IFN-γ水平均较治疗前明显降低，且脑脊液MBP水平较血清MBP水平降低更明显，差异有统计学意义（P＜0.01）。见表3。

表3 MS血清和脑脊液治疗前及治疗后的不同时间MBP水平及血清 IL-12、IFN-γ 水平比较的变化情况比较（±s，n=12）

表3 MS血清和脑脊液治疗前及治疗后的不同时间MBP水平及血清 IL-12、IFN-γ 水平比较的变化情况比较（±s，n=12）

注：与血清MBP比较，#P＜0.05

治疗前 治疗后第3天治疗后第3天F值 P值血清MBP水平（ng/mL）（ng/mL）7.62±1.74 12.07±3.42 30.25±8.92 8.29±1.31 5.84±1.85#21.78±6.34 3.89±0.1.67±0.2 15.67±4脑脊液MBP水平IL-12（pg/mL）IFN-γ（ng/mL）15.01±4.456.65±2.19 42 3#.10 2.93±1.17 8.253 9.527 7.143 5.647＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01

3 讨论

MS是一种中枢神经系统炎性脱髓鞘疾病，其病因及病理学机制至今仍未完全阐明，但MS自身免疫的发病机制已得到证实和公认[5]。各种原因导致髓鞘破坏后，血清或脑脊液中的MBP及血清IL-12、IFN-γ浓度增高，因此测定血清IL-12、IFN-γ及血清和脑脊液MBP的水平，可以用于反映中枢神经系统有无实质性损害及有无髓鞘脱失[6-7]。

本组研究结果显示，研究组大鼠血清和脑脊液中的MBP水平均显著高于对照组（P＜0.01），提示检测MBP含量变化是诊断MS的一项有价值的生化指标。表2结果显示，研究组急性发作期及缓解期大鼠血清及脑脊液中MBP水平、血清 IL-12、IFN-γ 分别明显高于对照组（P ＜ 0.01），说明大鼠活动期血清MBP明显升高，反映了损害的范围和严重程度，尤其对判断MS是否处于活动期具有重要的临床意义[8]；说明IL-12、IFN-γ是介导MS始发免疫反应的重要因子，可正向调节细胞免疫使病情加重，这也与有学者发现MS患者体内有高水平的循环IFN-γ的研究结论一致。

表2显示研究组12只大鼠，其中急性发作期 8只，其脑脊液中 MBP、IL-12、IFN-γ 水平最高。 Majewska 等[9-10]研究证实，MS患者急性期脑脊液MBP与临床评分关系密切，提出监测脑脊液MBP的变化水平，有利于判断MS的病情严重程度和预后。且大鼠脑脊液MBP和血清MBP水平呈正相关（r=0.562，P＜0.01），说明作为主要自身抗原之一的MBP对MS的发病敏感性高。有学者研究显示，IL-12在稳定期的原发进展型MS患者中显著升高，而血清IFN-γ含量的增高对MS引起病情加重，这说明检测患者CSF和血清中的MBP、IL-12、IFN-γ水平对于MS的诊断和疗效监测有重要参考价值。

他克莫司是一种新型免疫抑制剂，是一种广泛应用于器官移植的大环内酯类免疫抑制药物，于1984年从日本筑波山土壤中被分离到。他克莫司除了在抑制器官移植排斥反应方面具有显著疗效外，还广泛应用于斑秃、银屑病、鱼鳞病、糖尿病、白塞病、变应性皮炎、类风湿性关节炎以及MS等自身免疫疾病的治疗，在对脊髓损伤的模型中具有保护神经，营养神经和促进神经再生和抑制T细胞增生、活化的作用。研究组12只大鼠应用他克莫司治疗后，MBP水平在治疗前明显增加，但治疗后的第3天及治疗后的第7天的不同时间显著下降，血清IL-12、IFN-γ水平也显著下降。说明MS对他克莫司等激索类药物的短程疗效较好。国内外已有学者将他克莫司应用于自身免疫性疾病的研究，其中，Gold等[11]研究证实，他克莫司通过免疫抑制和神经保护作用显著改善小鼠的髓鞘脱失和轴突损伤。

综上所述，通过检测周围血和脑脊液MBP的水平，并动态观察应用他克莫司治疗前及治疗后MBP、IL-12、IFN-γ的变化情况，一方面对判断MS预后、病情严重程度和临床诊断具有重要的临床意义，另一方面可能为预防多发性硬化的临床复发提供一种有效的新药提供指导依据，但由于样本量过小，仍需日后在扩大样本量的基础上对其进一步深入研究。

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[4]姜红彦，王苏平，李宏元.多发性硬化患者血清IL-17水平和髓鞘碱性蛋白相关性的研究[J].大连医科大学学报，2011，32（2）：179-180.

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[11]Gold BG，Voda J，Yu X，et al.FK506 and a nonimmunosuppressant derivative reduce axonal and myelin damage in experimental autoimmune encephalomyelitis：neuroimmunophilin ligand-mediated neuroprotection in a model of multiple sclerosis[J].J Neurosci Res，2004，77（3）：367-377.