王晓婷梁志坚陈莉党超曾进胜

脑梗死后神经功能的重建一直是临床治疗的重点与最终目标。实验研究[1,2]显示，梗死灶周围神经干细胞的增生、分化以及毛细血管的再生等，都可能是实验动物神经功能恢复的结构基础。实验性单侧脑外伤后，损伤对侧(健侧)皮质脊髓束(corticospinal tract,CST)会不同程度发生新生纤维，在脊髓平面实现纤维重新分布，提示CST结构重塑也可能参与神经功能重建[3,4]。然而因发病机制不同，脑梗死后是否存在梗死对侧(健侧)CST重构，需要进一步观察。本研究采用生物素葡聚糖胺(biotinylated dextran amine,BDA)顺行性神经纤维示踪技术，在解剖结构上观察大鼠实验性脑皮层梗死后，健侧CST纤维发生重塑的现象，并进一步探讨其在脑梗死模型中神经功能重建过程的作用。

1 材料与方法

1.1 模型大鼠的制作 采用7～9周、体质量70～90g的雄性Sprague-Dawley大鼠，按双肾双夹法复制易卒中型肾血管性高血压模型[5]。术后12周，选取收缩压180mmHg以上，无自发性卒中大鼠12只，随机取6只经电凝法[6]行右侧大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)，余6只仅暴露中动脉不凝闭，入假手术组。

1.2 BDA顺行示踪标记 造模后14d，参照Zai等[7]方法予两组大鼠左侧运动皮层BDA注射。大鼠10%水合氯醛(3.5mL/kg)腹腔麻醉，立体定位仪头部固定，取顶部正中纵行切口，沿颅中线用咬骨钳向左咬成4mm×7mm的骨窗，微量注射器选运动区、进针皮层内2mm、缓慢注射10%BDA溶液0.2μL，完毕后封闭骨窗缝合。见图1A、B。

1.3 神经功能评分根据Ding等[8]脚步错误试验，计算大鼠左前肢通过一长方形网格(10cm×110cm)脚步滑脱的次数比值，数目越大说明神经功能越差。大鼠于检测前3d训练，术前1d(术后-1d)、术后3d、14d、28d检测，每只大鼠均测量3次取均值作为该时间点神经功能评分。

1.4 脑组织准备 BDA注射后14d，两组大鼠按上述方法麻醉。4℃生理盐水经升主动脉快速灌注，4℃4%多聚甲醛滴注固定约1h，断头取脑及脊髓。后固定24h，20%、30%梯度蔗糖溶液脱水，OCT包埋。经延髓、高颈髓(C1-2)冠状冰冻连续切片，片厚50μm，部分颈髓10μm，待后续处理。

1.5 BDA免疫检测 厚切片置于12孔板，依次孵育于 0.3%H2O230min、0.3%TritonX-10030min、抗生物素-生物素-过氧化物酶复合液(standard Elit ABC kit,Vector Labs)4℃过夜；次日于含4%硫酸镍胺的二氨基联苯胺(BDA,Dako)中显影10min，遂裱片、风干、脱水及封片。

1.6 BDA与GAP-43免疫双染颈髓薄切片于0.01 mol/L枸橼酸缓冲液、微波加热抗原修复5min，依次孵育于0.3%TritonX-10030min、5%牛血清蛋白1h、小鼠抗大鼠神经生长相关蛋白-43(growth-associated protein 43,GAP-43)抗体(1：400，millipore)4℃过夜。次日室温下孵育于Alexa 594偶联驴抗小鼠抗体(1：500，invitrogen)/Alexa 488偶联链酶亲和素(1：500，invitrogen)1h，封片。

1.7 图片采集与计数采用BX51系统生物显微镜采集图片，通过Image-Pro-Plus 6.0软件行BDA阳性纤维计数。①延髓水平BDA阳性纤维总数：在10×10倍视野下，计算BDA标记侧(健侧)的BDA阳性纤维数，每只大鼠测3个随机平面取均值作为该大鼠延髓水平BDA阳性纤维数，共6只大鼠，再算其均数作为该组大鼠延髓水平BDA阳性纤维总数；②非标记侧(梗死皮层支配侧)颈髓灰质内BDA阳性纤维数量比值：在10×10倍视野下，以通过中央管中点的直线为中线，计数所有越过中线并出现在非标记侧灰质内的BDA阳性纤维数，每只大鼠测25个随机平面的BDA阳性纤维数取均值，共6只大鼠，再算其均值，最后除以该组延髓BDA阳性纤维总数；③非标记侧颈髓CST的分布范围：在10×10倍视野下，同②分别计数距中央管中心：100μm、300μm、600μm及900μm界线发生交汇的BDA阳性纤维数比值；④相关分析双变量：MCAO组每只大鼠健侧CST芽生纤维数量，即参照②计算方法，每只大鼠非标记侧灰质内BDA阳性纤维数量减去假手术组6只大鼠同区域的BDA阳性纤维数均值；另外计算该只大鼠神经功能恢复程度，即功能评分[(d3-d28)/d3]。

1.7 统计学方法采用SPSS13.0分析。计量资料以x±s表示，组间数据用t检验，组内不同时间点的数据用单因素方差分析，两两比较用LSD法。双变量用Pearson相关分析。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 延髓CST纤维 两组大鼠标记侧延髓均可见CST被染成黑色，纤维排列整齐、致密、呈梭型，统计结果示MCAO组(2190.67±94.12)与假手术组(2205.67±96.81)CST纤维总数无统计学差异(t=0.272，P＞ 0.05)，见图1 C、D。

2.2 非标记侧颈髓BDA阳性纤维 两组大鼠颈髓平面均可见黑染的BDA阳性纤维由健侧(BDA标记侧)CST发出，在灰质前、后联合处越过中线，到达对侧(非标记侧)灰质区域，见图1E、F，而且MCAO组BDA阳性纤维可以分布到更远的区域，有时还可以看到纤维上出现结节样膨大，见图2A、B、C、D。BDA与GAP-43免疫双染色显示，非标记侧颈髓灰质区BDA阳性纤维，同时表达GAP-43，见图3。

统计结果示，MCAO组BDA阳性纤维数比值(11.90×10-4±1.46×10-4)较假手术组(3.77×10-4±0.73×10-4)增加(t=13.30，P＜ 0.001)。而且，MCAO组分别在距离中心各个距离界线的BDA阳性纤维数比值较假手术组均增加，见表1。

2.3 大鼠神经功能评分 与假手术组比较：MCAO组大鼠术前神经功能良好，术后各时间点功能缺失明显；MCAO组大鼠术后3d神经功能缺失最严重，之后逐渐恢复，见表2。Pearson相关分析显示，MCAO组每只大鼠术后功能恢复的程度，与其对应的每只大鼠健侧CST芽生纤维的数量，呈正相关(r=0.88,P＜0.05)。

图1 A：BDA注射点示意图;B：皮质脊髓束(CST)纤维走向及芽生纤维示意图;C(假手术组)/D(MCAO组)：延髓BDA标记纤维数，图中显示两侧CST数量和形态无明显差别，(标尺：200μm);E(假手术组)/F(MCAO组)：颈髓BDA标记阳性纤维图中箭头所示，标尺：70μm)，图中显示MCAO组纤维数明显多于假手术组

图 2 A：BDA阳性纤维在非标记侧灰质内的空间分布示意图。虚线表示中线，箭头指示为BDA阳性纤维;B：(假手术组);C：(MCAO组)均可发现BDA标记纤维分布到非标记侧灰质内，箭头所示为BDA标记纤维(标尺：150μm)，图中显示与假手术组比较，MCAO组BDA阳性纤维数明显增多，而且分布到更远的部位;D：C的局部放大，箭头所示为BDA阳性纤维上的结节样突触小体(标尺：20μm)

图3 非标记侧灰质内的BDA(绿色)与GAP-43(红色)的双重免疫荧光(黄色)染色。假手术组：A、B、C，MCAO组：D、E、F(标尺：20μm)图中显示非标记侧灰质内的BDA阳性纤维GAP-43表达阳性，同时MCAO组免疫双染阳性纤维数明显多于假手术组

表1 颈髓非标记侧灰质内与各条界线交汇的BDA阳性纤维数比值(x±s)

3 讨论

3.1 脑梗死后健侧CST发生重塑 BDA在皮层内细胞外注射后，可被锥体细胞胞体摄取、经轴突顺行运输均匀分布于轴突或轴突分支远端，显影后可清晰地观察神经纤维及其行程，是常用神经示踪剂。本研究使用BDA对健侧CST进行追踪，首先在两组大鼠延髓腹侧见BDA阳性的CST，其纤维总数相同，说明两组CST均没发生变异。在此前提下，两组大鼠才能科学比较位于颈髓非标记侧灰质内的BDA标记纤维。由于梗死侧CST不存在BDA，故出现在非标记侧灰质内BDA阳性纤维被认为是健侧CST轴突发出的侧枝纤维。本研究则证明了BDA阳性纤维起始于健侧CST，绕过灰质前、后联合，延伸至对侧灰质内各个板层。MCAO组BDA阳性纤维明显多于假手术组，并且具有行程长、形成突触样结构的特点。在正常生理条件下，颈髓CST存在小部分纤维交叉到对侧形成双侧支配的现象，假手术组非标记侧灰质内的BDA阳性纤维也证明了这一点，而MCAO组较假手术组增多的BDA阳性纤维，则应该是脑梗死后诱发CST芽生形成的新纤维。GAP-43属于神经生长标志物，主要分布于神经生长锥内。MCAO组BDA阳性纤维同时表达GAP-43，进一步说明脑梗死后，健侧CST芽生形成新纤维越过中线到达对侧。Emerick等[3]在实验性大脑皮层损伤动物模型中发现，健侧CST芽生纤维能越过脊髓中线终止于对侧灰质板层Ⅸ，并与前角α运动神经元建立突触联系。在本研究中，位于颈髓前角灰质BDA阳性纤维末梢呈现数个类似于Zai等[7]描述的结节样突触小体，提示该纤维可能与前角下运动神经元建立新的突触联系，具有执行一定神经功能的能力。

3.2 脑梗死后健侧CST重塑的意义 本研究中，实验性脑梗死大鼠神经功能逐渐恢复过程中，MCAO组每只大鼠神经功能恢复的程度与其颈髓CST芽生纤维数量呈正相关，提示健侧CST的重塑可能参与了大鼠脑梗死后神经功能的修复。

临床上多数患者于脑梗死后可以自发表现程度不等的功能恢复，其机制至今尚未阐明。绝大多数实验研究[1，2]着重于梗死灶周围神经组织的重塑，并证实其参与了神经功能恢复的部分机制。然而，进一步研究发现，梗死面积过大、梗死病灶周围瘢痕组织增生、血管再通或新生困难、远隔部位发生继发性损害、神经干细胞活化及分化不稳定等因素都严重限制了梗死侧神经组织重塑的程度，并可能是部分患者神经功能恢复不理想的可能原因[9]。然而，一侧脑梗死发生后，健侧大脑及CST不受上述因素影响，健侧CST的重塑更具修复缺损的优势，有可能成为进一步促进患者神经功能恢复的潜在目标部位。在脑损伤动物模型中，健侧CST轴突发芽、形成新生纤维越过脊髓中线到达对侧脊髓前脚灰质、形成突触结构，可能是动物神经功能恢复的结构基础[3,10]。本研究，首次观察到，MCAO大鼠健侧CST新生性重塑，参与了动物神经功能恢复的过程，为临床上改善脑梗死患者神经功能的研究，提供新的方法。

表2 大鼠脚步错误试验评分(x±s)

(本研究实验均在广东省重大神经疾病诊治研究重点实验室完成)

[1]Wang Y,Cooke MJ,Morshead CM,et al.Hydrogel delivery of erythropoietin to the brain for endogenous stem cell stimulation after stroke injury[J].Biomaterials,2012,33(9)：2681-2692.

[2]曹文锋，王卫真，高幼奇，等.立体定向移植骨髓间充质干细胞对脑缺血再灌注模型大鼠的治疗作用[J].中国神经精神疾病杂志，2011，37(7)：385-389.

[3]Emerick AJ,Kartje GL.Behavioral recovery and anatomical plasticity in adult rats after cortical lesion and treatment with monoclonal antibody IN-1[J].Behav Brain Res,2004,152(2)：315-325.

[4]Zhang Y,Xiong Y,Mahmood A,et al.Sprouting of corticospinal tract axons from the contralateral hemisphere into the denervated side of the spinal cord is associated with functional recovery in adult rat after traumatic brain injury and erythropoietin treatment[J].Brain Res,2010,1353：249-257.

[5]Zeng J,Zhang Y,Mo J,et al.Two-kidney,two clip renovascular hypertensive rats can be used as stroke-prone rats[J].Stroke,1998,29(8)：1708-1713.

[6]Xing S,Zhang Y,Li J,et al.Beclin 1 knockdown inhibits autophagic activation and prevents the secondary neurodegenerative damage in the ipsilateral thalamus following focal cerebral infarction[J].Autophagy,2012,8(1)：63-76.

[7]Zai L,Ferrari C,Dice C,et al.Inosine augments the effects of a Nogo receptor blocker and of environmental enrichment to restore skilled forelimb use after stroke[J].J Neurosci,2011,31(16)：5977-5988.

[8]Ding Y,Yao B,Lai Q,et al.Impaired motor learning and diffuse axonal damage in motor and visual systems of the rat following traumatic brain injury[J].Neurol Res,2001,23(2-3)：193-202.

[9]Allred RP,Jones TA.Unilateral ischemic sensorimotor cortical damage in female rats：forelimb behavioral effects and dendritic structural plasticity in the contralateral homotopic cortex[J].Exp Neurol,2004,190(2)：433-445.

[10]Oshima T,Lee S,Sato A,et al.TNF-alpha contributes to axonal sprouting and functional recovery following traumatic brain injury[J].Brain Res,2009,1290：102-110.