何文俊 刘红 叶玲玲 李世崇 王启伟 陈昭烈

胚胎干细胞（embryonic stem cells，ESCs）是一种未分化的具有自我更新能力的细胞，在胚胎发育和基因功能研究、药物筛选和新药开发、转基因动物种质培育以及组织修复和细胞治疗等领域显示出巨大优势和应用前景［1-3］。自1996年Pain等［4］首次在体外长期培养禽类胚胎干细胞（chicken embryonic stem cells，cESCs）获得成功以来，分离和培养禽类多能干细胞已成为转基因禽培育、珍稀禽类保种和脊椎动物早期发育研究模型制备的重要前提［5-7］。随着近年来由禽类胚胎干细胞衍生细胞系被越来越多地用作治疗性抗体和病毒疫苗的生产系统，禽类胚胎干细胞分离、培养和建系再次成为干细胞研究和应用的热点［8-10］。

由于禽类具有独特的生殖生理特点和胚胎发育过程，鸡的受精卵排出体外时处于胚胎发育的X期。X期胚胎中的胚盘细胞具有发育的全能性，且能参与各种组织的形成，从X期胚胎中可能会培养出多能性细胞。本研究从X期的鸡胚中分离胚盘细胞，旨在获得典型的呈集落生长的鸡ESCs克隆并在体外培养体系中保持未分化状态。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物 白来杭鸡种蛋购自中国农业科学院北京畜牧兽医研究所。昆明白孕小鼠（孕期14-16d）购自军事医学科学院实验动物中心。

1.1.2 主要试剂 高糖DMEM、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、鸡血清、100×非必需氨基酸和TRIzol购自Invitrogen公司；胰蛋白酶、HEPES购自Hyclone公司，明胶、β-巯基乙醇和DAPI购自Sigma公司；白血病抑制因子（LIF）和100×核苷购自Millipore公司，丝裂霉素C和链霉蛋白酶购自Roche公司，乙二……