张文丽 于寒松，2 朴春红 王舒婷 胡耀辉，2

葡萄糖淀粉酶（Glucoamylase EC3.2.1.3）又称γ淀粉酶（γ-amylase）或淀粉葡萄糖苷酶（Amyloglucosidase），简称糖化酶（缩写GA或G），是世界上应用范围最广、最重要的工业酶制剂之一［1］。随着世界经济的发展，能源短缺问题日益突出，可再生能源的开发利用问题受到高度重视。而糖化酶作为生产燃料乙醇必须的生物催化剂，在国际国内市场上的需求量大幅度上升，具有广阔的市场前景。然而，近30年来，糖化酶生产几乎成为一个被遗忘的角落，很少人继续从事这一课题的研究，致使菌种退化，产量下降，技术水平停滞不前。因此，开展糖化酶生产技术研究，选育优良菌株，革新生产工艺，已成为当务之急。这一研究不仅有利于传统酶制剂产业的技术进步，而且对应用酶制剂的相关产业的发展也具有巨大的推动作用［2］。

目前用于真菌分类鉴定的核酸序列分析最常选用的目的片段是rDNA。真菌基因组中编码核糖体的基因包括4种，28S rDNA、18S rDNA、5.8S rDNA和5S rDNA。真菌中18S rDNA是相对比较保守的序列，进化上变异性较小，且18S rDNA序列较长，相比之下包含了更多的遗传信息，使得对18S rDNA序列进行分析成为真菌分子学上鉴定菌种的主要方法［3］。本研究通过此方法，结合微生物自身特性对分离得到的一株产糖化酶菌株ZWL-1进行鉴定。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品 采自吉林某豆制品加工厂污水排放口处的土样。

1.1.2 主要培养基 （1）葡萄糖淀粉培养基：蛋白胨1.0％，酵母粉0.2％，牛肉粉0.3％，氯化钠0.2％，葡萄糖5％，玉米淀粉1.0％，琼脂粉1.7％，调pH值至4.6-5.0；（2）发酵培养基：葡萄糖8％，酵母粉0.5％，玉米糖浆1％，豆饼粉2％，磷酸二氢钾0.2％，硫酸镁0.02％，调pH值至4.6-5.0；（3）察氏培养基：蔗糖0.3％，硝酸钠0.2％，磷酸氢二钾0.1％，硫酸镁0.05％，氯化钾0.05％，硫酸亚铁0.001％，琼脂1.8％，调pH值至4.6-5.0。

1.1.3 仪器与设备 DL-CJ-IND超净工作台，北京市东联哈尔仪器制造有限公司；DHP120型恒温培养箱，上海实验仪厂有限公司；754型紫外可见分光光度计，上海光谱仪器有限公司；SY11-Ni电热恒温水浴锅，北京市长风仪器仪表公司；DYY-6C型电泳仪，北京市六一仪器厂；BI2720 PCR热循环仪，美国应用生物系统公司；GIS-2019凝胶成像系统，上海天能科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌种初筛 称取25 g土样于装有灭过菌的225mL生理盐水的三角瓶中，在磁力搅拌器上搅拌均匀，之后静置5min。采用梯度稀释法制备10-2-10-6的系列稀释液，分别吸取1mL均匀涂布于葡萄糖淀粉培养基上，每个处理设3个平行，30℃下培养5d后观察，在平板上倒入少量0.1mol/L的碘液，静置10min观察并测量菌落周围出现透明圈的直径（d /cm）和菌落直径（d /cm）［4］，再将有透明圈的未知菌株落编号并移至斜面培养基上，30℃培养3-5d，保存于4℃下，待下一步筛选。

1.2.2 菌种复筛 液体摇瓶培养：挑取1个单菌落于装有10mL蒸馏水的小三角瓶中，将菌落打碎后，按5％的接菌量接种于发酵培养基中，培养温度30℃，转速200r/min，培养5d。

1.2.3 粗酶液的制备 将发酵结束后的发酵液倒入50mL离心管中，以6000r/min，离心30min，得到的上清液为粗酶液［5］。测定酶活并计算糖化酶产率。

1.2.4 粗酶液酶活测定 经分离得到的糖化酶粗酶液按照GB8267—2006［6］测定标准酶活，空白用煮沸失活的酶液代替，每个样做3个平行。酶活定义：在40℃、pH4.6条件下每1h生成1mg葡萄糖所需的酶量。

1.2.5 菌株形态观察 将筛选得到的菌株ZWL-1接到察氏培养基平板上，置于30℃下培养，每隔8h观察菌落的颜色和形态。待菌丝长到盖玻片上后，每隔12h于显微镜下观察菌丝、分生孢子梗及分生孢子的大小和形态［7］。

1.2.6 菌株ZWL-1总DNA的制备 将制备好的孢子悬浮液接种于察氏液体培养基中，30℃，200r/min振荡培养5d。用灭过菌的四层纱布过滤，收集菌丝体，在-20℃的冰箱中预冷30min，再用液氮研磨，然后转移至EP管中，通过改良后的CTAB/NaCl法［8］提取基因组DNA，经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定其DNA的质量后作为PCR反应的模板。

1.2.7 菌株ZWL-1的18S rDNA序列PCR扩增 以基因组DNA为模板，利用自己设计的引物（利用Primer5.0 软件，根据GenBank发表的真菌18S rDNA保守基因序列设计的一对引物）对18S rDNA 基因进行扩增。引物序列为：上游引物：5'-AGCGAAACTGCGAATGGC-3'；下游引物：5'-CATCCTTGGCAAATGCTTTC- 3'。

50μL PCR 扩增体系：ddH2O 35.5μL，10×Ex Taq buffer 5.0μL，引物各 2.0μL，dNTPmixture 4.0μL，模板1.0μL，Ex Taq0.5μL。PCR 反应条件：94℃预变性4min；94℃变性 30s，55℃复性30s，72℃延伸100s，循环扩增30次；72℃延伸10min，于 4℃结束反应［9］。

1.2.8 18S rDNA序列同源性及系统发育树构建 登录 http//：www.ncbi.nlm.nih.gov， 将 测 序 结 果 用BLAST与在GenBank基因库中的14株其他真菌（表1）的18S rDNA序列进行同源性比对，寻找其同源关系，确定菌属。应用BIOEDIT 7.0中的Clustal X软件［10］和MEGA 5软件［11］经多重比较后构建系统发育树。

2 结果

2.1 产酶活力较高菌株的筛选

从吉林某豆制品厂污水排放口处土样中，经反复分离筛选，得到10株生长速度较快、透明圈与菌落直径之比（HC值）较大的菌株，经初筛和复筛，得到4株液态发酵产酶活力较高的菌株。其中菌株ZWL-1生长较快、透明圈与菌落直径之比（HC值）较大、酶产率较高，液体发酵酶产率高达12271U/mL，如图1和表2所示。故选定菌株ZWL-1作为供试菌株进行菌种鉴定。

表1 选自GenBank 中用于比对的真菌菌株

图1 菌株ZWL-1透明圈

表2 分离菌株HC值和发酵后酶产率

2.2 菌落形态

菌落在察氏培养基上菌落蔓延迅速，孢子成熟后菌落呈白色绒毛状（图2），外观干燥，不透明菌落与培养基的连接紧密，不易挑取；在液体培养基中，振荡培养，形成白色小球；显微镜下观察到分枝繁茂且具横隔的菌丝体，菌丝透明，形成多分枝轮廓，分生孢子梗，直立无色，小枝对生，分生孢子褐色球形，若干分生孢子在分生孢子梗上聚集成孢子头。初步鉴定为半知菌亚门，丝孢纲，丝孢目，丛梗孢科，曲霉属。

图2 分离获得的高产糖化酶菌株ZWL-1的菌落形态

2.3 18S rDNA基因PCR扩增

以提取的ZWL-1的基因组为模板，经PCR扩增后，进行1％琼脂糖凝胶电泳，获得一条约900bp的特异性条带（图3）。

图3 菌株ZWL-1的18S rDNA基因 PCR扩增产物

2.4 菌株ZWL-1的18S rDNA序列同源性和系统发育分析

2.4.1 菌株ZWL-1的18S rDNA测序结果 将ZWL-1的18S rDNA PCR扩增产物送去上海生工测序，菌株ZWL-1得到一条长度为905bp的18S rDNA基因片段（已去除引物序列），将序列提交GenBank，得到登录号为：KC433410。

2.4.2 菌株进化树的建立 将所获得的菌株ZWL-1的18S rDNA序列登录NCBI，通过在线BLAST分析，菌株ZWL-1的18S rDNA序列与黑曲霉（Aspergillus niger）最相似，序列同源性均在99％以上。选取14种与其相似性均为99％以上的已知菌种的18S rDNA基因核酸序列进行多序列排列构建进化树，如图4所示。

图4 菌株ZWL-1 18S rDNA系统发育树

3 讨论

菌种的形态特征是由遗传物质和生存环境等因素共同决定的，利用基于形态学、生理生化及分子生物学等技术的多相分类鉴定方法现已广泛应用于微生物分类学研究领域［12］。因此在真菌菌种鉴定和分类时，利用多相分类学技术的综合使用，是保证分析和鉴定更加准确的必要前提。目前用于鉴定物种的分子标记和分子技术有SCCP、DDGE、DDTE、RFLP、RAPD、16S rDNA及 18S rDNA， 其 中 18S rDNA 已经多次应用于真菌的鉴定。真菌的分类鉴定方法主要有两大类，一类是表型鉴定，另一类是分子生物学鉴定，对菌体进行形态观察属于表型鉴定，而通过18S rDNA 基因序列分析法属于分子生物学鉴定［13］。本研究中通过对菌株ZWL-1为期1周的形态学定期观察和显微镜下观测，也只能确定到属。18S rDNA基因序列法从基因水平明确种属分类，基因序列分析是以核酸为基础，受到外界环境影响较小，不依赖于人肉眼观察，无个体差异，结果偏差比表型鉴定小，是一种相对准确的鉴定方法。

本研究利用自己设计的引物对ZWL-1 18S rDNA基因序列扩增和序列测定，并通过BIOEDIT软件中的Clustal X软件将菌株ZWL-1的18S rDNA基因片段序列与14种与其相似性均为99％以上的已知菌种的18S rDNA基因核酸序列进行多序列排列用Neighbor-joining方法［14］构建进化树，并采用Bootstraping法［15］评估其准确度，最后用MEGA 5软件进行系统进化分析，从构建的系统进化树中可以看出，ZWL-1与Aspergillus sp.LQ21共同构成一个分支，并与黑曲霉（Aspergillus niger strain CS1-1）聚成一大支。因此，ZWL-1被鉴定为黑曲霉属。黑曲霉为半知菌亚门真菌，在察氏琼脂培养基上生长时，菌丝初为白色，后变黑，常出现黄色区带，厚绒状，反面无色或略带黄褐色。但本研究中筛选得到的菌株ZWL-1，在进行形态观察培养时其菌丝由始至终为白色，猜测是ZWL-1的原始菌株在受到长期环境的影响发生了表型变异。由于黑曲霉生长发育较快，分泌产生的代谢物种类和性质可能会具有其特殊性，若该菌产酶能力保持稳定并对其再进一步优化，该菌株有可能作为一种新型的工业生产菌株，发挥该菌的生物学功能和实现其生产利用价值，提高传统糖化酶制剂的发酵产率。

由于糖化酶具有重要的应用价值，国内外越来越多的研究者正在将目光投向糖化酶的基础研究和工业应用中。接下来我们将进一步研究该菌产糖化酶的结构，如糖链在糖化酶活性、稳定性及构象状态中所起的作用，进一步阐明糖化酶的多型性原因及糖化酶的热稳定性机制。

4 结论

从吉林某豆制品加工厂污水排放口处土样中经反复分离筛选得到4株活较高的菌株，经液态发酵产酶优化得到1株产糖化酶活力较高的菌株ZWL-1。结合形态鉴定和 18S rDNA 序列分析的结果，最终确定该菌属于黑曲霉属（Aspergillus niger），且测定该菌具有较高的糖化酶活性。

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