陈奕涵 钱悦 侯永泰 周庆玮 甘人宝 管世敏 荣绍丰

透明质酸（Hyaluronic Acid，HA）是由N-乙酰氨基葡萄糖与葡萄糖醛酸为双糖单位等摩尔聚合而成的酸性黏多糖［1］，相对平均分子量多在104-107Da之间，不同分子量的HA具有不同的应用领域，由于HA独特的黏弹性和生理功能，HA已被广泛应用于医药、化妆品和食品领域。

C类的兽疫链球菌和马疫链球菌都可以合成HA，鉴于HA在发酵液中以游离状态存在，具有易于分离纯化和工业化生产等优点，因此目前工业上主要采取发酵法获取HA。然而链球菌对于培养基营养条件要求苛刻及不同HA分子量难于通过代谢调控获得等劣势已展现出来，以传统的工艺优化难以满足市场需求。由于基因工程手段构建工程菌表达HA则具有成本低，便于代谢调控以及下游纯化工艺便捷等优点，已成为未来工业化获取HA的首选方法。研究表明，has操纵子在链球菌中的表达是合成HA所必需的，has操纵子是由3个基因hasA、hasB/ugd和hasC组成，分别编码HA合成酶、UDP-葡萄糖脱氢酶和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶，对于HA合成代谢具有显著影响的则是hasA和hasB/ugd基因。将hasA与hasB/ugd基因导入表达菌株并在适宜的培养条件下则可获得 HA［2，3］。

UDP-葡萄糖脱氢酶（UDP-GlcDH）存在于动物、植物与细菌中，可以将UDP-葡萄糖转化成UDP-葡萄糖醛酸（UDP-GlcA），UDP-GlcA是形成结构多糖和细胞生长代谢必不缺少的前体物质［4，5］。Sheng等［6］研究结果表明高活性的UDP-GlcDH更有利于HA的生成。PL启动子受λ噬菌体CI基因的调控，CI基因温度敏感性突变体所产生的CI857阻遏蛋白在低温30℃时候具有阻遏作用，在高于37℃时候阻遏蛋白失活并且解除阻遏，促使PL启动子转录［7］。本实验室对大肠杆菌BL21（DE3）与YK537进行ugd基因克隆，重组连接于含有PL启动子的pBLMVL2载体上，分别将重组质粒转化到BL21（DE3）与YK537中进行升温诱导表达，考察不同菌株的UDPGlcDH的酶活，旨在为后续利用大肠杆菌表达系统表达来自链球菌的hasA基因以及超表达大肠杆菌ugd基因，并最终合成HA奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 质粒与菌种 质粒pBLMVL2（内含PL启动子，SD序列）、大肠杆菌（Escherichia .coli）TOP10、BL21（DE3）与YK537均为本实验室保存。

1.1.2 主要试剂与仪器 本试验所用化学分析纯试剂购自国药集团；DNA抽提试剂盒、质粒小量抽提试剂盒、PCR产物回收试剂盒、胶回收试剂盒等分子生物学试剂购自上海生工；Pyrobest DNA polymerase、限制性内切酶、T4 DNA Ligase等购自大连宝生物公司；UDP-葡萄糖和NAD＋购自Sigma公司。Scientz-IID超声波细胞粉碎机购自宁波新芝生物科技股份有限公司。

1.1.3 培养基和抗生素 大肠杆菌采用LB培养基培养；重组表达株采用M9CAA培养基（含1％酸水解酪蛋白和1％葡萄糖的M9培养基），氨苄青霉素浓度为 100μg/mL。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA提取 取大肠杆菌BL21（DE3）与YK537甘油菌转接于LB培养基中过夜培养，次日参照DNA抽提试剂盒方法提取基因组总DNA，并用紫外分光光度计验证其纯度。

1.2.2 大肠杆菌ugd基因引物设计与PCR 通过对NCBI中已公布的大肠杆菌CFT073（NC_004311），大 肠 杆 菌 BL21（DE3）（NC_012971.2，NC_01289-2.2），大肠杆菌K-12（NC_000913）的ugd基因的保守序列对比，设计出ugd基因的上游引物和下游引物，上游引物：5'-GGATCCATGAAAATCACCATTTCCGGTA-3'（内含BamH I位点），下游引物：5'-CCCAAGCTTATTAGTCGCTGCCAAAGAGATCG-3'（内含Hind Ⅲ位点），引物合成由上海生工完成。

分别以BL21（DE3）与YK537的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，反应条件：95℃预变性10min；94℃变性1min，57℃退火1min，72℃延伸1min 30s，共32个循环；最后72℃延伸10min。参照PCR产物纯化试剂盒要求回收ugd基因。

1.2.3 重组质粒的构建 用EcoR I酶切处理质粒pBLMVL2，将处理后的开环质粒再采用Mung Bean Nuclease进行黏性末端的平滑化，平滑化后放入65℃水浴15min热处理再采用Hind Ⅲ酶切，最后采用低熔点胶电泳分离并使用胶回收试剂盒回收处理后载体，对PCR回收后的ugd基因采用Hind Ⅲ单酶切，将以上处理完的载体和ugd基因采用T4 DNA Ligase进行16℃过夜连接，次日转化到E.coli TOP10中涂布于氨苄平板（含氨苄青霉素100μg/mL）并进行挑选单克隆，对抽提质粒进行采用BamH I、HindⅢ双酶切和PCR鉴定，重组质粒测序工作由上海生工完成，筛选出目的基因来自E.coli BL21（DE3）的重组质粒pBLBugd，目的基因来自E.coli YK537的重组质粒pBLYugd。

1.2.4 重组质粒在大肠杆菌中的表达 将pBLBugd、pBLYugd分别转化到BL21（DE3）与YK537中，获得 重 组 菌 BL21（DE3）（pBLBugd）、BL21（DE3）（pBLYugd）、YK537（pBLBugd）和 YK537（pBLYugd）。将对照组BL21（DE3）（pBLMVL2）与以上4株重组菌先接种到LB培养基中37℃，200r/min培养12h，紧接着按照2％的接种量分别转接到M9CAA培养基中30℃，200r/min培养12h，次日按照10％接种量分别再次转接到M9CAA摇瓶培养基中，35℃，200r/min培养2h后分别升温到38℃、40℃、42℃条件下进行诱导表达，以上培养条件均采用100μg/mL氨苄青霉素稳定质粒。在38℃、40℃、42℃诱导条件下，将对照组BL21（DE3）（pBLMVL2）和以上4株重组菌分别取诱导前和诱导后6h菌液12000r/min离心10min，弃上清后采用等体积PBS（pH7.5，10mmol/L）溶液重悬浮后离心取沉淀，弃上清加入15μL 2×SDS loading buffer，煮沸5min后离心取上清进行SDS-PAGE电泳。

1.2.5 UDP-葡萄糖脱氢酶酶活的测定 分别取诱导前和诱导一定时间后菌液3mL在12000r/min离心，弃上清后在4℃条件下重悬浮于1mL PBS（pH7.5，10mmol/L）溶液中，在冰浴条件下选取300 V电压，超声3 s间歇5 s对其进行超声破碎20min，离心取上清作为粗提液。以1mL反应体系为酶活测定体系，其中包括5mmol/L UDP-葡萄糖，5mmol/L NAD＋，100mmol/L Tris-HCl（pH8.0）及 5μL 粗酶液［8］。酶活反应在30℃下进行，用紫外分光光度计（UV-2100 spectrophotometer）检测340nm处吸光度的增加来确定反应体系中NADH的生成，酶活的定义为30℃条件下该反应体系中每分钟生成2μmol NADH为1 U［9］。蛋白的浓度采用Brandford方法测定。

1.2.6 UDP-葡萄糖脱氢酶比酶活的计算 UDPGlcDH酶活的计算根据根据朗波尔定律ΔA=εCL和酶活定义，其中ΔA为酶促反应初期一分钟吸光度的增加值，ε为NADH在340nm处的摩尔吸光系数，C为NADH浓度，L为比色皿厚度，本试验中ε取NADH 微摩尔消光系数为 0.0062 （μmol/L）-1·cm-1［10］。本试验测定酶活体系为1mL（Vt），加入超声后粗酶液是为5μL（Ve），比色皿厚度为1cm，其中参照Brandford方法测定粗蛋白浓度为Cp（mg/mL），则 有 比 酶 活（U/mg）=ΔA·Vt/（2εL·Ve·Cp），将本试验体系代入数值即为UDP-GlcDH比酶活的计算公式：U/mg=ΔA/（0.062×Cp）。

2 结果

2.1 UDP-葡萄糖脱氢酶基因ugd的扩增及重组质粒的验证

从 BL21（DE3） 与 YK537基 因 组 总 DNA 中PCR扩增得到的基因分别为Bugd与Yugd，琼脂糖凝胶电泳后可以在目的条带处观察到清晰条带（图1），将重组质粒分别进行BamH I/Hind Ⅲ双酶切后电泳在1.2 kb和5.2 kb处出现两条清晰条带（图2），与预期结果一致，结果表明目的基因已成功连接到质粒pBLMVL2中。

图1 ugd基因的PCR电泳结果

图2 重组质粒的双酶切验证

2.2 ugd基因序列的测定与序列比对

采用PL启动子序列分别对pBLBugd和pBLYugd进行测序，测序结果（图3）表明，Bugd基因与GenBank中NC_012971序列完全一致，测序获得Yugd基因上传NCBI并获得序列号JX187363，将其与Bugd基因测序结果进行序列对比，核苷酸序列对照结果显示Yugd基因与Bugd基因同源性为98.37％，氨基酸同源性为99.74％，仅在184位氨基酸出现差异（图片未显示），以上结果表明已成功构建出重组质粒pBLBugd和pBLYugd。

图3 克隆得到的Yugd基因序列

2.3 ugd基因保守区段的分析

利用NCBI在线软件（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi/）对Yugd序列进行分析，结果（图4）表明，Yugd氨基酸序列属于典型UDP-葡萄糖/GDP-甘露糖脱氢酶家族，它具有3个典型的区域，分别是N端的NAD＋结合区（2-83）和C端的NAD＋结合区（300-385），中间部分为UDP-葡萄糖/GDP-甘露糖脱氢酶中央结构域（191-280）。Bugd氨基酸序列采用在线软件分析后结果与Yugd一致，以上3个典型的区域分布也说明了184位氨基酸差异为无义突变引起，不会显著影响UDP-葡萄糖脱氢酶的活性。

图4 ugd基因保守区段的分析

2.4 ugd基因在大肠杆菌中的表达

将重组质粒pBLBugd和pBLYugd分别转化BL21（DE3）与YK537，所得重组菌在38℃、40℃、42℃升温诱导条件下稳定地表达ugd基因，经SDS-PAGE分析（图5），在43kD条带处较诱导前均出现明显蛋白条带，与大肠杆菌UDP-葡萄糖脱氢酶理论分子量43.6kD基本相当。

2.5 对影响重组表达UDP-葡萄糖脱氢酶（UDPGlcDH）活性的因素分析结果

2.5.1 恒定诱导温度对重组菌表达UDP-GlcDH活性的影响 含有空载体的BL21（DE3）（pBLMV2）具有宿主菌BL21（DE3）自身的ugd基因，但是由于其微量表达和测定体系灵敏度等原因，在本酶活测定中未检测到UDP-GlcDH酶活，而含有pBLBugd与pBLYugd重组质粒的表达株均获得高活性UDPGlcDH的表达（图6）。在38℃诱导条件下UDPGlcDH比酶活在升温诱导6h均达到最大，且38℃诱导条件下表达UDP-GlcDH采用BL21（DE3）较优于YK537。在40℃诱导条件下，BL21（DE3）（pBLBugd）与YK537（pBLYugd）在升温诱导4h时达到比酶活最大值，而BL21（DE3）（pBLYugd）与YK537（pBLBugd）在升温诱导6h时达到比酶活最大值；在42℃升温诱导条件下，YK537（pBLYugd）在升温诱导4h后获得比酶活最大值，另外3株重组菌在6h后获得最佳比酶活。

2.5.2 两阶段温度诱导对重组菌表达UDP-葡萄糖脱氢酶（UDP-GlcDH）活性的影响 为了兼顾UDPGlcDH的高活性表达、透明质酸合成酶的胞内表达活性以及HA的合成对胞内环境温度的要求，考察了两阶段温度诱导表达UDP-GlcDH的两种方法：①先升温至40℃诱导1h后降温至38℃继续诱导；②先升温至42℃诱导1h后降温至38℃继续诱导。结果（图7）表明，两阶段温度诱导4株重组菌均在诱导6h达到酶活最大值，较恒定温度诱导条件下UDP-GlcDH酶活均有了提高，其中先升温至42℃诱导1h后降温至38℃继续诱导更适于高活性UDPGlcDH的表达。

图5 UDP-葡萄糖脱氢酶蛋白电泳分析

2.5.3 酵母粉对重组表达UDP-葡萄糖脱氢酶（UDPGlcDH）活性的影响 在两阶段温度诱导方法的基础上，在42℃升温前1h，向M9CAA培养基中加入1％的酵母粉，然后42℃升温诱导1h后降温至38℃诱导表达使得UDP-GlcDH活性得到显著提高（图8），同时也相对延长了UDP-GlcDH在胞内的保持活性的持续时间。

图6 不同诱导温度下重组菌表达UDP-GlcDH酶活与升温诱导时间关系

3 讨论

由于大肠杆菌具有遗传背景清楚，表达体系稳定以及大规模发酵经济等优点，常用作外源基因表达的高效宿主，采用大肠杆菌体系是获得稳定高效地表达HA较好的选择［11-13］。IPTG作为tac启动子与trc启动子常用的诱导物，碍于IPTG的毒害性以及成本因素的考虑此诱导体系仅仅只能适用于基础研究，PL启动子与trp启动子由于成本低廉常用作大规模表达体系的诱导，尤其是PL同时作为受到严格控制的温敏型转录强启动子，用于多种目的产物的表达，已具有显著优势［14］。我们采用在38℃、40℃、42℃温度条件下分别进行诱导表达所购建的重组菌，获得不同活性的UDP-GlcDH，推测原因主要是在38℃诱导条件下，体系已经显著抑制阻遏蛋白CI857的活性，目的基因已开始表达，虽然Bugd与Yugd在基因序列上有1.63％的差异性，但在38℃诱导温度下由于PL启动子的强转录效率没有充分得到释放，因基因序列上的差异性而引起目的基因在翻译过程中密码子的偏好性未展现出来，4株重组菌均在诱导6h时候获得比酶活最大值；40℃诱导结果表明，因目的基因的差异性而显示翻译过程中密码子的偏好性已得到体现，以致出现BL21（DE3）（pBLBugd）与YK537（pBLYugd）表达酶活的相对滞后现象；文献报道，在42℃条件下由于PL启动子获得高效率转录，以BL21（DE3）为宿主菌表达效率较优于 YK537［15］，故在本试验 BL21（DE3）的表达体系中，由于目的产物瞬时表达量过高而以致形成大量包涵体，导致上清液中可溶性UDP-GlcDH较少从而影响了酶的比活，而YK537在表达Yugd基因时，由于不是最佳宿主，反而因为表达UDPGlcDH速率相对较低，在兼顾表达自身Yugd基因优势的条件下，拥有更为充足的时间去完成重组蛋白的折叠和修饰，大量UDP-GlcDH以可溶性形式存在，出现42℃条件下YK537（pBLYugd）在升温诱导4h后获得酶活最大值，同时高于其它两个温度诱导条件下的比酶活值，而BL21（DE3）（pBLBugd）即使表达自身基因Bugd也没有像40℃条件下4h即可达到比酶活较大值，主要原因可能由于包涵体的存在影响了UDP-GlcDH的比酶活。在升温诱导的后期，重组蛋白的大量表达和高温诱导条件下的热诱导会产生热休克蛋白，而研究表明热休克蛋白中含有许多蛋白水解酶［16，17］，会降解部分重组蛋白，从而可能引起在升温诱导一段时间后出现UDP-GlcDH的活性下降。

图7 两阶段诱导条件下重组菌表达UDP-GlcDH酶活与诱导时间关系

图8 双阶段诱导并添加酵母粉条件下重组菌表达UDPGlcDH酶活与诱导时间关系

近年来Mao采用巴斯德杆菌提供hasA基因，大肠杆菌K5菌株提供ugd基因，在大肠杆菌内获得了HA的表达，但是诱导体系中采用IPTG作为诱导物，Liang等采用了NICE控制系统在乳酸乳球菌中成功表达了HA，Sheng等也在乳酸乳球菌中使用Nisin和乳糖作为诱导剂，分别诱导含hasA质粒和 hasB 质粒进行差异化表达 HA［2，6，13］，终究碍于诱导条件的制约仅仅只能用作基础研究。本试验采用PL启动子升温诱导自身ugd基因表达HA的关键酶UDP-GlcDH，在不同温度下诱导表达UDP-GlcDH的比酶活远远高于张晋宇等［23］采用T7启动子在大肠杆菌体内表达兽疫链球菌的UDP-GlcDH比酶活；UDP-GlcA的含量是形成HA的关键限制因素，而高活性的UDP-GlcDH和一定的酶活持续时间则是产生大量UDP-GlcA的必需条件。PL启动子采用升温诱导方式具有大规模工业化表达目的产物的优势，避免化学诱导剂的缺陷，有利于下游HA的分离纯化，即使对于大规模发酵升温诱导方式具有传热效率较为缓慢的弊端，然而缓慢升温诱导反而更利于目的产物的表达［24］，在此基础之上本研究确定了两阶段升温诱导方式可以显著提高UDP-GlcDH活性，延长UDP-GlcDH在胞内保持高活性的持续时间，从而为后续hasA基因参与大肠杆菌中采用双质粒差异性诱导表达HA提供了依据，为HA的链延伸提供了充足的时间。

4 结论

分别克隆了大肠杆菌BL21（DE3）与YK537的ugd基因，并采用PL启动子在不同条件下升温诱导表达UDP-GlcDH，显著高于已有报道中采用大肠杆菌表达兽疫链球菌或者马疫链球菌hasB基因的UDP-GlcDH活性。

两阶段升温诱导较恒定温度诱导条件下可以减少包涵体的形成，在一定程度上提高了UDP-GlcDH活性和延长了UDP-GlcDH在胞内的持续时间。

两阶段升温诱导前1h，向M9CAA培养基中加入1％的酵母粉，然后42℃升温诱导1h后降温至38℃诱导表达，可以使UDP-GlcDH活性得到最佳表达。

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