王 佶 安 宇 周水珍 王 艺 刘仁超

脊髓性肌萎缩症( SMA) 是常染色体隐性遗传性神经肌肉病，人群中发病率为1/6 000 ～1/10 000 活产婴儿，最近报道中国人群SMA 致病基因的携带者频率为1/42［1］。SMA 居致死性常染色体隐性遗传病第2 位，仅次于囊性纤维变性［2～4］。位于染色体5q11.2 ～q13.3 上的运动神经元存活( SMN) 基因是SMA 的主要致病基因，具有两个高度同源的拷贝SMN1 和SMN2，两者仅有5 个碱基的差别，分别位于第7、8 外显子和第6、7 内含子中。既往研究已证实SMN1 基因突变可导致SMA 发病，SMN2 基因是临床表型的调节基因，拷贝数增加可减轻SMA 的表型［2，5］。近年来中国对SMN2 基因的研究较少［6，7］，缺乏表型与基因型的分析研究，同时SMA 基因诊断国内多采用PCR-RFLP 分析技术，可判断SMN 基因纯合缺失，但不能分析杂合缺失。本研究纳入临床诊断的SMA 患儿，以多重连接探针扩增( MLPA) 技术行SMN1 基因缺失和SMN2 基因拷贝数检测，分析其与临床表型关系，以丰富中国人群SMA 研究数据。

1 方法

1.1 SMA 诊断标准与分型 神经专科医生根据发病年龄、临床表现及病情进展程度进行临床诊断［8］，检测到SMN1 基因缺失可确诊。根据1992 年国际SMA 协作组制定的儿童型SMA 的临床分类标准，分为3 个亚型［8］:Ⅰ型:6 月龄内发病，全身肌肉无力，肌张力减退，不能坐和站立，通常在2 岁内死于呼吸衰竭； Ⅱ型:6 月龄后发病，能坐但不能独自行走，多数在进入青春期前死于呼吸系统并发症；Ⅲ型:18 月龄后发病，能坐和行走，预期寿命不减少，起病初可表现为走路不稳和易跌倒等症状。

1.2 研究对象 复旦大学附属儿科医院( 我院) 临床诊断为SMA 的患儿，纳入SMN1 基因第7 和8 外显子检测到突变的确诊病例，同时检测患儿父母的SMN1 基因，分析杂合突变情况。本研究SMA 相关致病基因的检测均获得患儿家属的口头知情同意。

1.3 MLPA 拷贝数分析 采集患儿外周静脉抗凝血3 mL，采用QIAgen 公司试剂盒( QIAamp DNA blood MiNi Kit 1250，Cat No.51106) 抽取DNA 溶液2 ～5 μg，-20℃保存。

参照SMA MLPA 检测试剂盒( SALSA MLPA P060-B2 SMA probemix，MRC，荷兰) 的操作说明进行DNA 变性、探针杂交、连接和荧光引物PCR 扩增，应用ABI 公司的3130自动化序列分析仪进行扩增片段分离、峰高和峰面积的检测。检测数据应用GENEMAKER 1.95 软件分析处理。根据试剂盒的说明推算SMN1 和SMN2 基因第7 和8 外显子的拷贝数: SMN1 或SMN2 的信号与内参信号的比值为0.7 ～1.3，拷贝数为2，表示为正常；比值为0.35 ～0.65，拷贝数为1，为杂合缺失； 比值为0 表示没有拷贝，为纯合缺失；比值为1.3 ～1.5，拷贝数为3；比值为1.5 ～2，拷贝数为4。以拷贝数2 为参照，多于2 个拷贝数即为重复。

1.4 统计学方法 计量资料以表示，计数资料以百分比表示，率的显著性采用χ2检验，P ＜0.05 为差异有统计学意义。采用SPSS 16.0 软件进行统计分析。

2 结果

2.1 SMN1 基因拷贝数与临床表型关系 41 例临床诊断SMA 患儿进行了基因检测，37/41 例( 90.2%) SMN1 基因第7 和( 或) 第8 外显子纯合缺失进入分析，其中36 例(97.3%) 为第7 和8 外显子均纯合缺失( 图1A) ，1 例仅第7 外显子纯合缺失。男20 例，女17 例。平均发病年龄(7.5 ±7.0) 个月，3 d 至6 月龄19 例，～18 月龄14 例，～3岁2 例，＞3 岁2 例。Ⅰ型20 例( 54.1%) ，Ⅱ型15 例(40.5%) ，Ⅲ型2 例( 5.4%) ，Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型平均发病年龄分别为(2.9 ±1.8) 、(10.7 ±1.9) 和(30.0 ±8.5) 个月。

2.2 SMN2 基因拷贝数与临床表型关系 37 例SMN1 基因第7 和( 或)8 外显子纯合缺失患儿中，SMN2 基因第7 和8 外显子拷贝数2 为18 例(48.6%) ，平均发病年龄(4.9 ±3.9) 个月，Ⅰ型13 例( 72.2%) ，Ⅱ型5 例( 27.8%) ； 第7和8 外显子重复( 拷贝数3 或4) 为17 例( 45.9%) ( 图1B) ，第7 外显子重复为2 例( 5.4%) ，平均发病年龄( 9.9 ± 8.5) 个 月，Ⅰ型7 例( 36.8%) ，Ⅱ型10 例(52.6%) ，Ⅲ型2 例( 10.5%) ，Ⅱ和Ⅲ型的比例显著高于拷贝数2 的病例( P ＜0.05) 。

图1 SMA 患儿SMN1 和SMN2 基因MLPA 检测结果Fig 1 The results of SMN1 and SMN2 gene detection with MLPA method in SMA children

2.3 SMN1 基因杂合缺失与表型 5 例患儿父母行SMN1基因检测，检出杂合缺失9 例，其中4 例患儿父母均为SMN1 基因第7 和8 外显子杂合缺失( 图1C) ；1 例患儿父亲为SMN1 基因第7 和8 外显子杂合缺失，母亲未检测到纯合或杂合缺失。5 例患儿父母均未见肌肉无力及萎缩等临床表现。另有1 例检出SMN1 基因第7 和第8 号外显子杂合缺失，其临床特征、肌电图及肌肉活检均符合SMAⅠ型的诊断，尚待SMN1 基因测序明确是否存在SMN 基因点突变。

3 讨论

SMA 的辅助检查主要有肌电图、肌酶和肌肉活检。肌电图是定位诊断，但特异度不高。肌酶在鉴别其他肌无力疾病中有参考意义，但对SMA 诊断无特异性。肌肉活检由于取材的创伤性，患儿不易接受，因此SMA 的基因检测受到临床的青睐。既往采用的PCR-RFLP 法由Lefebvre 等［9］建立，除不能分析杂合突变外，实验要求高、操作繁琐和稳定性差等限制了其在临床的广泛应用。国内也有采用荧光定量PCR 技术检测SMN 基因拷贝数的报道，该方法检测灵敏，但因优化为稳定和高效的实验体系较困难，且不同实验室采用不同的内参照无法互相比较，对于重复大于3 以上的拷贝数难以准确计数，其用于临床检测的实用性不如MLPA。MLPA 是一种高通量、针对待测核酸中靶序列进行定性和半定量分析的技术［10］，可对待测基因所有外显子进行缺失、重复及某些点突变检测［11］，国外已有采用该技术分析SMN 基因纯合缺失、杂合缺失和拷贝数的报道［12，13］。我院自2011 年10 月起在临床应用MLPA 技术用于SMA的诊断。

研究表明80% ～90%的SMA 为SMN1 基因纯合缺失，5% ～10%的SMA 是由于SMN1 基因发生复合杂合突变所致，即一个SMN1 等位基因缺失，另一个SMN1 等位基因发生点突变［14，15］。欧美人群中SMN1 基因纯合缺失检测已成为诊断和排除诊断SMA 的首选方法［16］。本文41 例临床诊断SMA 患儿SMN1 基因第7 和( 或) 8 外显子纯合缺失检出率为90.2%，提示可作为SMA 患儿的首选确诊方法，特别是松软婴儿( floppy infant) 在婴儿期临床表现难以做出临床诊断时，且肌电图不能做出定性诊断时，肌肉活检对于小婴儿也存有一定困难时，基因检测的价值更大。本文9/10 名患儿父母检出杂合缺失，但均无临床表现，为携带者；提示检测杂合突变一方面可以防止漏诊，另一方面也可为产前诊断和咨询提供依据。

SMN2 基因产生10%全长转录产物，是临床表型的调节基因，基因拷贝数越多，产生全长转录产物也增多［5］，可部分补偿SMN 蛋白的不足，减轻SMA 表型严重程度［17］，也可预测SMA 急性或慢性病程［18］。Feldkǒtter 等［2］对375例SMA 病例的研究也显示，SMN2 基因拷贝数与SMA 表型严重程度呈负相关。本文采用MLPA 技术对SMN2 基因拷贝数变异检测，显示拷贝数为2 个的18 例患儿平均发病年龄较早［(4.9 ±3.9) 个月］，其表型以Ⅰ型为主( 13 例) ；SMN2 基因拷贝数3 或4 患儿的平均发病年龄稍晚［(9.9 ±8.5) 个月］，表型以Ⅱ型为主( 10/17 例) ，提示基因拷贝数检测可作为临床判断SMA 预后的方法之一。

本文的局限性:SMA Ⅲ型患儿例数较少，且未进一步细化分析临床表型和基因拷贝数的相关性，待今后研究进一步完善。

致谢:感谢参加本研究的患儿及家属；感谢复旦大学附属儿科医院神经科医生和儿科研究所技术人员的支持。

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