于 游，张才全

（重庆医科大学附属第一医院普外科 400016）

Id蛋白［1］又称为分化抑制因子（inhibitor of differentiation，Id），是新的准原癌基因［2］，在多种肿瘤中有异常的表达，参与了肿瘤细胞增殖、凋亡、浸润、迁移以及肿瘤血管生成等多方面相关行为的调控［3－8］。Id1在结肠癌组织中表达明显高于正常组织及结肠癌旁组织［9］，故研究Id1与结肠癌的关系，对于进一步阐明结肠癌的生物学行为以及治疗将会有积极意义。本研究在体外过表达及抑表达Id1情况下检测结肠癌HT－29细胞血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）mRNA和蛋白的表达情况以及肿瘤细胞增殖情况，以探讨Id1在结肠癌细胞增殖中的作用。

1 材料与方法

1.1 试剂 Id1一抗购于Miliipore公司；山羊抗兔二抗购于北京中杉生物有限公司；RNA提取试剂盒购于Takara公司；RT－PCR试剂盒购自Tiangen公司；Trisbase购于上海生工生物工程有限公司；EXTaq酶购于Takara公司；dNTP购于Takara公司；VEGF一抗购于 Miliipore公司；脂质体ipofect amine 2000购于Invitrogen公司；Id1基因的特异性小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）Si－Id－1－001（19bp）［10］由广州锐博生物公司设计与合成，各自的正义和反义序列分别为：正义链5′－UGA GCA AGG UGG AGA UUC U dTdT－3′，反义链3′－dTdT ACU CGU UCC ACC UCU AAG A－5′。

1.2 细胞培养与Id1过表达及抑表达质粒构建及转染 人结肠癌细胞（human colon cancer cells，HT－29）株由中科院上海细胞库提供；HT－29经复苏后，常规培养于含10%新生小牛血清，青霉素（100U／mL），链霉素（100μg／mL）的1640培养基中。Id1全长基因扩增Id1：上游引物：5′－TAA CTG TTC CAT TTT CCG TA－3′，下游引物：5′－TTA CCA CCA TCT AAA TTA TTT G－3′，扩增长度：975bp，退火温度：60℃，采用 Pfu保真酶扩增。PCR扩增Id1片段，利用限制性内切酶EcoR I和NotI将其连接至载体pGEx－4T－1，将连接产物转化大肠杆菌，挑取单菌落，提取质粒，经PCR和双酶切鉴定后测序。转染前1d，将2.5×105个细胞／孔接种于6孔培养板。过表达分为3组：空白组：仅加培养血清；……