李 汇，毛用敏，赵莉莉，崔让庄，王佩显

（1.天津医科大学 300070；2.天津市胸科医院 300051）

基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）是降解细胞外基质（extracellular matrix，ECM）成分的主要酶系［1］，金属蛋白酶组织抑制剂（tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMPs）是MMPs的内源性特异性抑制剂［2］。近年研究发现，MMPs／TIMPs的比例失衡与动脉粥样硬化、冠状动脉介入术后再狭窄以及心脏重塑等病理过程密切相关［3］。以腺病毒（adenovirus，AdV）为载体介导TIMP1到靶细胞，调节ECM的生成和降解，从而调节粥样斑块的稳定性可能成为冠心病基因治疗的新方法［4］。本研究构建携带人基质金属蛋白酶组织抑制剂因子1（human tissue inhibitor of matrix melall oprolease－1，hTIMP1）基因片段的重组腺病毒 Ad－hTIMP1［5］，并成功感染体外培养的人脐静脉内皮细胞CRL－1730，从而为进一步的在体实验提供平台，为基因治疗动脉粥样硬化，稳定粥样斑块提供靶基因的线索。

1 材料与方法

1.1 材料 AdEasy复制缺陷型腺病毒载体系统（穿梭质粒pAd－Track－CMV和骨架质粒pAdEasy－1）以及包装细胞系人胚肾细胞（human embryonic kidney 293T，HEK293T）购自北京大学实验室；pUCm－T载体质粒，BJ 5183菌株、JM109菌株和DH5α菌株均为本实验室保存。TaqDNA聚合酶为本实验室提取保存，限制性内切酶BglⅡ、NotⅠ和DNA marker购自TakaRa生物工程（大连）有限公司，PacI购自NEB公司；T4 DNA连接酶、高纯度质粒柱式提取试剂盒和脂质体购自Invitrogen公司，胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）和 DMEM高糖培养液购自美国Gibco公司；PCR引物由上海生工公司合成。DNA测序由北京三博远志生物工程公司完成。

1.2 腺病毒重组质粒的构建

1.2.1 pUC－hTIMP1重组质粒的构建 Genebank中搜索人TIMP1序列，设计上游引物为：5′－AGA ACC CAC CAT GGC CCC CT－3′；下游引物为：5′－GAT TCA GGC TAT CTG GGA CCG－3′。从人心肌细胞中提取总RNA，反转录PCR（reverse transcription－PCR，RT－PCR）得到人 TIMP1的基因片段，连接到pUCm－T载体质粒中，转化入感受态JM109细胞，NcoI酶切鉴定正确后行二次转化入JM109进行扩增，测序正确后提质粒pUC－hTIMP1。……