徐小川，姚 源，田 伟，石 锐，陈大福，张秀丽

（1.北京积水潭医院口腔科，北京 100035；2.北京市创伤骨科研究所，北京 100035；3.北京市第六医院口腔科，北京 100007）

海藻酸盐是从海洋褐藻中提纯的天然多糖，应用在制药和生物医学工程领域［1－3］，缺点是在生理环境下容易失去物理性状，而且对蛋白质吸附能力不佳，从而限制了其深入应用于上述领域；淀粉是陆生的天然多糖，其价格不足前者的1／10。增塑淀粉（thermoplastic starch）是北京市创伤骨科研究所参与研发的生物可降解材料，比普通淀粉的弹性和强度都有所增加。该材料具有分子量大、对小分子物质有超强包容性、凝胶化能力强等特点，因而可替代海藻酸盐作为可降解材料，若加入止血剂或骨形成蛋白等因子则可用作止血、诱导成骨等组织工程材料［4］，有望在生物医药、组织工程领域广泛应用［5］。

宿主微环境中物理、化学、生物因素对生物材料的降解和转归有很大影响，建立能模拟宿主体内微环境的研究平台，从事可重复、可控的体外实验，将使材料的评估更加客观［6］。但具体评价方法和指标尚无法达成共识［7］，因此，本实验依照医疗器 械 标 准 YY／T 0127.2－93［8］、YY／T0127.1－93 及 ISO／TR7405－1984［9］、YY／T 0244－1996［10］有关规定，从急性全身毒性反应、溶血实验、短期全身毒性试验3种方法对其生物安全性进行初步评价研究。

1 材料与方法

1.1 急性全身毒性反应［8］

1.1.1 材料 增塑淀粉4g（北京化工大学提供），置入有20 mL生理盐水的三角瓶，经37℃浸提72h制成浸提液。小白鼠雌雄各10只，体质量17～23g。

1.1.2 方法 小鼠雌雄随机分为实验组和对照组，每组10只。实验组小鼠腹腔恒速（不超过0.1mL／s）注射浸提液50 mL／kg，对照组注射同批号灭菌生理盐水，于注射后24、48、72 h观察和记录实验组和对照组动物体质量、一般状态、毒性表现和死亡动物数。

1.1.3 统计与分析 通过SPSS13.0软件分析，考虑初始体质量、时间、组别进行具有一个协变量一个重复测量两因素定量资料方差分析。

1.2 溶血实验［8］

1.2.1 材料 增塑淀粉5g，经清洗处理后置烧瓶中加入生理盐水10mL作为实验组。阴性对照为同批号0.9%氯化钠注射液，阳性对照为蒸馏水，各准备3瓶待测。

1.2.2 方法 将实验组、阴性对照、阳性对照各组烧瓶置于37℃水浴中30min。然后在各瓶中加入新鲜稀释兔血0.2 mL轻轻摇匀，在同温水浴中维持60min，取上清液于545nm波长测定吸光度。溶血率计算公式：溶血率（%）＝［（实验样品的吸光度－阴性对照的吸光度）／（阳性对照的吸光度－阴性对照的吸光度）］×100%。

1.3 短期全身毒性试验 经口途径［8］。

1.3.1 实验动物 12只SD大白鼠，体质量420～480g，随机分为对照组和实验组，每组6只，雌雄各半，并标记大鼠。

1.3.2 灌胃剂制备 将增塑淀粉制成浓度20%的混悬液，4℃环境保存待用。

1.3.3 灌胃 用连有灌胃针的注射器灌胃，给服剂量为每日1g／kg体质量，对照组给服同体积的浸提介质（0.9%生理盐水）。记录大鼠体质量并依此调节灌胃剂量，时间7d。停止灌胃后再连续测量体质量5d。

1.3.4 结果判断及统计学处理 观察大鼠的体质量变化、运动和呼吸状态以及死亡情况。采用SPSS13.0统计软件进行分析处理，采用Wilcoxon秩和检验、考虑连续灌胃第7天体质量、时间、组别进行具有一个协变量、一个重复测量两因素定量资料方差分析。

2 结 果

2.1 急性全身毒性反应结果 在24、48、72h观察期内，两组动物状况良好，进食及运动如常，行动敏捷，无痉挛、运动障碍和死亡等毒性反应，体质量逐日增加。对两组初始体质量（20.80±1.40，19.60±1.58）采用t检验，结果显示两组比较差异无统计学意义（t＝1.80，P＝0.09），说明两组之间初始体质量具有可比性（表1）。两组之间在24、48、72h体质量比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。

初始体质量在统计学上的意义重大（F＝15.21，P＝0.000 3）（见表2），同一组各时间点之间有统计学差异（F＝10.19，P＝0.000 2），组别与各时间点之间比较无交互作用（F＝0.11，P＝0.894 3）。考虑初始体质量影响后，实验组与对照组间24、48、72h体质量变化无统计学意义（P＝0.175 8，0.175 8，0.375 6），见表3。

表1 各组各时间点描述性统计分析结果体质量（g

表1 各组各时间点描述性统计分析结果体质量（g

组别 初始24h 48h 72h实验组 20.80±1.40 21.80±1.48 22.80±1.40 24.20±1.75对照组 19.60±1.58 22.20±1.48 23.20±2.15 24.20±2.39

表2 考虑初始体质量、时间、组别进行具有一个协变量一个重复测量两因素定量资料方差分析结果

表3 考虑初始体质量影响后两组各时间体质量变化比较

2.2 溶血试验结果 见表4。经计算增塑淀粉溶血率＝2.06%。

2.3 短期全身毒性试验（经口途径）结果 见表5。对灌胃后体质量变化分析如下（表6）：初始体质量在统计学上的意义重大（F＝219.30，P＜0.000 1），将组别因素和时间因素共同考虑时两组比较差异无统计学意义（F＝1.42，P＝0.246 5），但各组间及各时间点间比较差异有统计学意义（F＝5.42，P＝0.044 9；F＝5.88，P＝0.000 8）。停止灌胃后两组各时间点体质量变化见表7。

表4 增塑淀粉溶血吸光度值

表5 灌药7d中两组各时间点体质量比较

表5 灌药7d中两组各时间点体质量比较

时间 实验组 对照组t P第1天436.33±34.72 443.67±31.23 －0.384 7 0.708 6第2天 425.33±37.43 442.33±28.66 －0.883 3 0.399 2第3天 423.00±32.81 441.67±30.81 －1.015 9 0.333 7第4天 417.00±36.22 442.33±31.07 －1.300 4 0.223 3第5天 416.33±34.30 438.67±33.03 －1.148 9 0.277 4第6天 409.00±34.77 433.33±30.16 －1.294 8 0.225 0第7天411.67±34.86 429.67±32.51 －0.925 1 0.376 8

表6 连续灌胃第7天体质量、时间、组别进行具有一个协变量一个重复测量两因素定量资料方差分析

表7 停止灌胃后两组各时间点体质量变化（g

表7 停止灌胃后两组各时间点体质量变化（g

指标 实验组 对照组t P第1天412.60±32.83 424.67±36.54 1.36 0.196 3第2天 415.60±33.86 423.00±35.30 2.30 0.038 6第3天 417.00±35.16 423.33±36.98 2.50 0.026 5第4天 419.00±36.55 424.33±36.43 2.70 0.018 1第5天420.67±35.72 431.00±40.77 1.70 0.113 5

3 讨 论

对于接触人体或在体内使用的生物材料，其化学性能将会直接影响人体的安全性。因此，对材料中的残留单体、有害金属元素、各种添加剂应严格控制。只有通过生物学评价来进一步确认这些用品是否安全，以便决定是否可以最终在临床使用。一是动物体内实验，即将材料植入体内，分阶段将植入体与周围组织取出，做组织学观察；另一类为体外试验，即用材料或材料浸提液观察材料对组织细胞生长、代谢及增殖方面的影响［9］。1997年国家医疗器械生物学评价标准GB／T16886等采用ISO10993－1992标准，促进了中国生物医用材料研究的发展和水平的提高［10］。生物学评价流程为首先进行体外生物学评价（如溶血试验、细胞毒性试验），根据结果对产品提出改性建议，合格后再进行体内动物学评价（如急性全身毒性、短期全身毒性）和动物实体模拟试验，再根据体内试验结果对产品提出进一步改进的建议，最后进行临床研究。

血液相容性指标是针对植入物材料生物安全性的关键参数，但由于体内环境的复杂性及不确定性，目前尚无完善的评价标准。本实验遵照国家YY／T0127.1－93的要求，采用直接接触方法，测得材料的溶血率为2.06%（表4），指标在正常上限的50%以下，提示该材料优于国家标准［8］。

在急性全身毒性和经口短期全身毒性中，除了动物体质量和死亡是可以明确判断的指标外其余均属于描述性语言，因而在动物零死亡且惟一的定量指标是“体质量”的情况下，引入统计学分析可以使结果更加有理可依。

急性全身毒性试验中选用的统计学方式除了考虑初始体质量外，如急性全身毒性试验初始体质量在统计学上的意义重大（表2，F＝15.21，P＝0.000 3），还加入了组别及时间因素综合考虑，如同一实验中组别与各时间点之间比较无交互作用（表2，F＝0.11，P＝0.894 3），在此基础上显示实验组与对照组间24、48、72h体质量变化比较差异无统计学意义（表3，P＝0.175 8，0.175 8，0.375 6），避免了大量信息因统计学方法选择不当而丢失，所得结果可信度大大提高。

短期全身毒性——经口途径是医药行业标准中针对接触骨组织、血液组织所必须的评价实验［11］。采用 Wilcoxon秩和检验并考虑连续灌胃7d体质量、时间、组别进行具有一个协变量一个重复测量两因素定量资料方差分析。考虑组别和时间因素（表6，F＝1.42，P＞0.05）提示增塑淀粉对实验动物未造成伤害。

停止灌胃2～4d两组动物体质量有差异，可能的原因是对照组中一只动物灌胃致食道损伤引发体质量变化而产生偏倚，但在第5天体质量已无差别（t＝1.70，P＝0.113 5），提示灌胃产生的损伤2～3d才能恢复。

增塑淀粉作为替代海藻酸盐的可降解组织工程材料，在体外和体内实验中显示了较好的安全性能，有研究将其与聚乙烯醇联合制备为引导组织再生膜［5］明显优于聚乳酸和聚乳酸－羟基乙酸共聚物膜，进一步的材料学改善将使增塑淀粉尽快进入临床试验。

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