周 龙，费 樱，马 莉，谭玉洁，3△

（1.重庆三峡中心医院生化科，重庆 万州 404000；2.贵阳医学院附属医院中心实验室，贵阳 550001；3.贵阳医学院附属白云医院检验科，贵阳 550014）

妊娠期糖代谢异常包括妊娠期糖尿病（gestational diabetes mellitus，GDM）和妊娠期糖耐量受损（gestational impaired glucose tolerance，GIGT）。有关研究资料表明，GDM与GIGT的总体发病率逐年升高，达7.6%［1］，其发生与遗传、环境及生活习惯密切相关，但发病机制和病因至今还在研究之中。Hanis等［2］首次报道了CAPN－10基因与2型糖尿病（type 2diabetes mellitus，T2DM）连锁不平衡。国内外学者纷纷对CAPN－10基因与糖尿病的关系展开研究。目前，同时对GIGT、GDM与CAPN－10基因以及相关危险因素的报道较少。本文就贵阳地区汉族GDM、GIGT患者的CAPN－10基因19、43及63位点多态性进行研究，并探讨与糖代谢异常发生相关的因素，以期为GDM、GIGT的发病机理研究提供实验室数据。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选取2009年10月至2010年11月在贵阳市妇幼保健院及贵阳医学院附属医院门诊就诊的孕妇，排除有孕前糖尿病史、慢性高血压、内分泌疾病、结缔组织疾病、慢性肝病等系统性疾病，以及长期使用类固醇激素者，行50g葡萄糖负荷试验（glucose challenge test，GCT）及75g口服葡萄糖耐量试验（oral glucose tolerance test，OGTT）。采用相关的诊断标准将受试者分为糖耐量正常（normal glucose tolerance，NGT）组、GIGT组和GDM组，每组100例，均为汉族，年龄在25～35岁之间，对每位孕妇进行问卷调查，建立临床资料，包括年龄、身高、体质量、受教育程度、孕次、自然流产次数、孕前体质量指数（body mass index，BMI，BMI＝体质量／身高2）、孕期体质量指数、孕期体质量指数的变化（即△BMI＝体质量的变化／身高2）、有无糖尿病家族史等。研究对象均符合伦理学要求，经孕妇本人知情同意。

1.2 筛查程序及诊断标准 GCT以口服50g葡萄糖后1h血糖大于7.8mmol／L为异常，对异常者做OGTT试验，采用葡萄糖氧化酶法测定血糖。根据乐杰主编的《妇产科学》第6版教科书标准，空腹12h后，口服葡萄糖75g，测空腹血糖（fasting plasma－glucose，FPG）及服糖后1、2、3h共4个时点的血糖即2h血糖（two hour plasma－glucose，2h－PG），正常值分别为5.6、10.3、8.6、6.7mmol／L，其中有2项或者2项以上超过正常值可诊断为GDM，1项异常者诊断为GIGT。

1.3 研究方法

1.3.1 基因组DNA提取方法 采用用酚－氯仿法提取基因组DNA，并测定DNA的纯度和浓度，－20℃保存备用。

1.3.2 CAPN－10基因19、43及63位点基因型分析 （1）PCR引物序列：引物设计应用primer premier 5软件，由北京赛百盛公司合成。PCR扩增反应体系：PCR反应体系25μL，其中 Taq DNA 酶2.5U、dNTPs 2mmol／L、PCR 染料2.5 μL、10×PCR Buffer（含 Mg2＋）2.5μL、上下游引物各10pmol及模板DNA 100ng。（2）PCR反应条件：19位点：94℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环后72℃延伸7min；43、63位点退火温度分别为59℃、64.5℃，其他同上。（3）PCR扩增产物的检测：取上述PCR产物5μL，于3%琼脂糖凝胶电泳后，在DNA成像分析仪下观察目的条带的位置。（4）CAPN－10基因的多态性检测分析：19位点多态性是32bp的2次或3次重复多态性，其PCR产物可直接电泳分为3个基因型，即22纯合子（404bp）、12杂合子（372 bp和404bp）、11纯合子（372bp）；SNP 43、63多态性检测采用聚合酶链式反应－限制性片段长度多态性（PCR－RFLP）方法。SNP 43位点的PCR产物经NsiI内切酶37℃水浴6h酶切成121bp和23bp的2个片段，电泳后可出现GG型（144 bp）、GA型（144、121、23bp）和 AA型（121、23bp）3种基因型。SNP 63位点的PCR产物经HhaI内切酶37℃水浴6h酶切成162bp和30bp的2个片段，电泳后可出现TT型（192 bp）、CT型（192、162、30bp）和CC型（162、30bp）3种基因型。

1.4 统计学处理 使用SPSS11.5软件进行数据处理。以Hardy－Weinberg平衡检验各位点基因频率在群体中的代表性；计量资料的两组间比较采用t检验，以表示；各组之间基因型和等位基因的分布差异采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义；采用单因素和多因素Logistic回归分析疾病发生的相关因素。

2 结 果

2.1 遗传平衡定律检验 CAPN－10基因19、43、63位点的基因型频率经Hardy－Weinberg定律检验，均符合遗传平衡法则，表明各基因频率满足遗传平衡（P＞0.05），等位基因的分布具有群体代表性。

2.2 研究对象的临床特征 与NGT组比较，GIGT组的孕期BMI、△BMI、FPG及2h－PG均升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；GDM 组的年龄、孕期BMI、△BMI、糖尿病家族史、FPG及2h－PG均显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1、图1；与GIGT组比较，GDM组的FPG、2h－PG均升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.3 CAPN－10基因19、43、63位点基因型、等位基因频率分布

2.3.1 CAPN－10基因19位点基因型、等位基因频率分布与NGT组比较，GIGT、GDM组基因型及等位基因频率的分布差异均无统计学意义；GIGT与GDM组的基因型频率、等位基因频率分布差异无统计学意义（表2）。提示CAPN－10基因19位点的长度多态性可能与GIGT、GDM的发病无关。

表1 研究对象的临床特征

表2 CAPN－10基因19位点基因型、等位基因频率分布

表3 CAPN－10基因43位点基因型、等位基因频率分布

表4 CAPN－10基因63位点基因型、等位基因频率分布

2.3.2 CAPN－10基因43位点基因型、等位基因频率分布GG基因型频率在GDM组较NGT组显著升高，差异有统计学意义（P＜0.01）；G等位基因频率在GDM组较NGT组升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；GIGT组与GDM组比较，其基因型频率、等位基因频率分布差异无统计学意义（表3）。

2.3.3 CAPN－10基因63位点基因型、等位基因频率分布在NGT、GIGT和GDM组间两两比较，其基因型频率、等位基因频率分布差异无统计学意义（表4）。提示CAPN－10基因SNP 63位点可能与GIGT、GDM的发病无关。

图1 NGT组、GIGT组及GDM组的孕前BMI、孕期BMI及△BMI比较

2.4 妊娠期糖代谢异常的相关危险因素分析

2.4.1 单因素Logistic回归分析 对纳入观察的年龄、身高、体质量、受教育程度、FPG、2h－PG、孕次、自然流产次数、孕前BMI、孕期BMI、△BMI、糖尿病家族史、SNP 43位点、SNP 63位点和19位点一共15个因素进行单因素Logistic回归分析，筛选出年龄、孕期BMI、△BMI、糖尿病家族史、SNP 43位点5个有意义的变量，结果显示糖尿病家族史危险性最大，OR为7.232，其次为SNP 43位点，其余也显示增加了患GIGT和GDM的危险性（表5）。

表5 单因素Logistic回归分析结果

2.4.2 多因素Logistic回归分析 以NGT组、GIGT组和GDM组为因变量，年龄、孕期BMI、△BMI、糖尿病家族史和SNP 43位点为自变量，建立多因素Logistic回归模型。分析结果表明，在5个变量中，影响妊娠期糖代谢异常发病的危险因素从大到小依次为：SNP 43、糖尿病家族史、△BMI、孕期BMI、年龄。SNP 43的OR值最大，为8.105；其次为糖尿病家族史，为5.821，强烈提示SNP 43和糖尿病家族史增加了GIGT和GDM的危险度；其他包括年龄、孕期BMI、△BMI均与GIGT、GDM的发生具有相关性（表6）。

表6 多因素Logistic回 归模型结果

续表6 多因素Logistic回归模型结果

3 讨 论

CAPN－10是calpain家族的一员，为细胞内钙依赖的半胱氨酸蛋白酶，存在于包括骨骼肌、肝脏和胰腺的许多组织中［3］，可参与细胞凋亡、增殖、分化等过程，调节细胞内信号传导，脂肪细胞分化以及胰岛素诱导的胰岛素受体1下调［4］。CAPN－10基因位于2号染色体长臂（2q37.3），该区域与T2DM连锁不平衡，该基因存在多种SNP，其mRNA在胰、肌肉和肝脏中表达，它可能与胰岛素分泌、胰岛素作用和肝脏中葡萄糖的产生有关［5］，若基因发生变异时会出现胰岛素的分泌和功能异常，导致胰岛素抵抗的发生。

CAPN－10基因最初是由Horikawa发现的，他指出该基因的3个SNP（43、19、63）与墨西哥美籍人T2DM 关联。其中SNP 43的G／G纯合子显著增加了罹患T2DM的危险度。Leipold等［6］对GDM患者及正常对照妊娠妇女的CAPN－10基因多态性（SNP 19、43、63）进行研究，结果发现该基因SNP 63位点C等位基因与GDM遗传易感性相关，而与19、43位点无相关性。随后Shaat等［7］对斯堪的纳维亚妇女CAPN－10基因多态性进行研究，结果显示这一地区的GDM妇女和正常妊娠者其SNP 43和SNP 44没有显著差别。田静等［8］、罗毅平等［9］、周龙等［10］在对 CAPN－10基因多态性（SNP 19、43、63）的研究中发现，SNP 43位点多态性与GDM遗传易感性有关，而与SNP 19、63则无关。同时，罗毅平等［11］通过对GDM患者脂肪及胎盘组织中CAPN－10mRNA的表达研究发现，脂肪组织该基因表达的减少可能是GDM患者胰岛素抵抗的重要原因，而胎盘中该基因的表达则与GDM及其胰岛素抵抗的关系不明显。本研究结果显示在CAPN－10基因19、63位点上，GDM组、GIGT组与NGT组的基因型频率、等位基因频率分布差异均无统计学意义。而在43位点上，GDM组GG基因型频率和 G等位基因频率（92%、94.5%）明显高于对照组（75%、87.5%），差异有统计学意义 （P＜0.05）。这提示CAPN－10基因SNP 43位点多态性与GDM遗传易感性有关，而与SNP 19、63位点可能与GDM的发生无关。这一结果与Leipold等［6］、Shaat等［7］的研究存在差异，但与田静等［8］、罗毅平等［9］结论一致。这些研究结果之间的差异性表明，GDM的遗传易感性存在着种族、地域的差异，同时GDM患者的多基因、多因素可能对CAPN－10基因的影响较大，可能GDM是多种遗传和环境因素等共同作用的结果。此外，样本的数量也可能对研究结果产生影响。

对于与妊娠期糖代谢异常发生有关的因素，国内外已有大量研究报道。糖尿病家族史、高龄、肥胖是公认的GDM的高危险因素［12］，但仍有一些因素还在探讨和研究中。遗传因素在GDM的发生中起着相当重要的作用。余平芝［12］进行前瞻性研究中显示，如果父母同时患糖尿病则孕妇妊娠期糖代谢异常发生的危险性较无家族史者增加9倍，而且家族中糖尿病患者越多以及与孕妇亲缘关系越近，孕妇GDM发生的危险性越大。本次调查单因素及多因素非条件Logistic回归分析结果中，糖尿病家族史的OR值分别为7.232和5.821，与GIGT、GDM发病呈正相关，表明糖尿病家族史是妊娠期糖代谢异常发生的高危因素。

由于肥胖者体内脂肪对胰岛素不敏感，产生胰岛素抵抗及葡萄糖不耐受，使胰岛素分泌过多，引起胰岛素下调，增加糖尿病发生的危险性。而肥胖妊娠妇女在妊娠后期的胰岛素抵抗及敏感性下降则更为显著［13－14］。母体肥胖已经是GDM较明确和公认的高危因素。有研究［15－16］显示，超重、肥胖和严重肥胖者比正常体质妊娠妇女更容易发生GDM。本研究显示，GDM组和GIGT组的孕期BMI、△BMI明显高于对照组，本文还应用单因素及多因素Logistic回归分析结果显示孕期BMI、△BMI的危险性也大大提高（P＜0.01），也证明了肥胖可增加糖代谢异常发生的危险性，提示孕妇可通过饮食和运动等来控制体质量，以减少肥胖的发生，进而减少GDM的发生，因此，控制妇女肥胖也是预防GDM发生的重要因素。

由于妊娠期的糖代谢特点，妊娠本身具有促进糖尿病形成的作用。随着年龄增长，糖尿病的发病率也增加。有研究显示35岁以上的孕妇糖筛查异常率是25岁以下者的2～4倍，GDM发生率是5.5倍［17］。本研究通过单因素和多因素Logistic回归分析OR值分别为1.275、1.027，P＜0.05，均显示出孕妇年龄可增加妊娠期糖代谢的危险性。

人们的文化程度可决定其社会地位、自我保健意识等，可直接影响着人们的生活习惯、行为方式及精神状况等方面。有调查研究［18］显示文化程度与糖尿病的发病相关，文化程度高是糖尿病的保护因素，表明文化程度越高，发生糖尿病危险性越低。这可能与文化程度较高的人群，了解和掌握更多的预防保健知识，更注重身体健康和自我保健有关。目前，对于受教育程度与妊娠期糖代谢异常的关系报道不多，但在本研究中，多因素Logistic回归分析结果未显示受教育程度与GDM发病的相关性（P＝0.053，OR＝0.536），这可能与妊娠这一特殊的生理时期有关，也可能是与研究对象的样本量有关，需要在今后的研究中进一步研究讨论。

综上所述，妊娠期糖代谢异常的发生是多源性的，是遗传、社会及饮食等多因素多种环境共同作用的结果，同时，糖尿病的发生也与种族、民族及地域等相关。孕妇在孕24～28周进行糖尿病筛查是必要的，还应加强对妊娠期健康教育的大力宣传，培养健康的生活方式、饮食习惯，适量运动和普及人群糖尿病预防及保健知识等综合措施。同时，对具有高危因素的孕妇应重点监护，指导其合理饮食，控制其体质量增长，对血糖密切监测，并早期进行筛查，以减少妊娠期糖代谢异常的发生，减少对母婴的危害。

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