兰 天，常秀亭，勾红菊，吴 腾，王丽京△，黄河清▲

（1.广东药学院血管生物学研究所，广州 510006；2.中山大学药学院，广州 510006）

肾小球系膜细胞（glomerular mesangial cells，GMC）的增生、肥大及其功能改变如分泌细胞外基质是糖尿病肾病肾小球硬化的主 要 病 理 基 础［1－2］。 磷 酸 鞘 氨 醇 （sphingosine 1－phosphate，S1P）是细胞膜组成成分磷脂的代谢产物，鞘氨醇激酶1（sphingosine kinase 1，SphK1）催化S1P生成，促进细胞存活和保护细胞免受凋亡损伤［3－5］。研究发现，用糖基化终末产物（advanced glycation end products，AGEs）处理 GMC后，发现SphK1活性与S1P增高［6］。鉴于此，本研究采用链脲佐菌素（streptozocin，STZ）诱导的糖尿病肾损伤大鼠模型观察其肾组织SphK1－S1P信号通路的变化，为探寻将SphK1－S1P信号通路作为抗糖尿病肾病的可能作用靶点奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物 雄性SD大鼠（175～200g）购自中山大学实验动物中心，在SPF级环境下饲养，自由摄食、饮水。采用新鲜配制的链尿佐菌素（STZ）60mg／kg体质量溶于10mmol／L枸橼酸缓冲液，pH 4.5（Sigma公司），大鼠尾静脉注射复制糖尿病模型。正常对照组注射等体积的枸橼酸缓冲液。采用One－Touch Ultra血糖仪（Johnson ＆Johnson Co.，Milpitas，California，USA）检测血糖。造模后72h测量空腹血糖，大鼠血糖浓度大于16.7mmol／L纳入糖尿病模型标准。糖尿病模型组与正常对照组各8只大鼠，大鼠每周称量体质量，每月测量血糖。实验周期为12周。

1.2 生化分析 在实验结束时，称大鼠体质量，置于代谢笼收集24h的尿液。血肌酐和24h尿蛋白经中山大学第一附属医院病理科分析。大鼠处死后，分离肾脏，称重并一部分固定在4%的多聚甲醛溶液；另一部分液氮速冻后置于－80℃冻存。肾脏肥大指数用肾重体质量比表示。

1.3 肾脏形态学研究 在实验结束、收取完尿液、血液与标本，大鼠处死后、用PBS全身灌流，分离肾脏，然后在4%的多聚甲醛中固定过夜，石蜡包埋。切片4μm厚度进行PAS染色。采用光镜分析肾小球硬化程度和系膜区扩展程度。用苏木精染核后，每个切片观察50个肾小球。通过计算肾小球横切面来评价肾小球肥大。切片采用Olympus数字光学显微镜进行拍照并转换成数字图片格式。肾小球横切面采用图像分析软件Image Pro.Plus（Media Cybernetics，Inc.，Bethesda，MD，USA）进行分析。每个动物分析50个肾小球，计算均值并进行统计分析。

1.4 定量Real－time PCR检测mRNA水平 按照TRIzolTM（Invitrogen）说明书提取组织或细胞的总RNA。总RNA逆转录后，采用Bio－Rad iCycler Iq system进行定量real－time PCR。用于扩增的 引物序 列如下：SphK1（forward primer，5′－GGC AGC GAA CCC CAC CAC TC－3′；reverse primer，5′－GCG GGT GTC TGG TGA CTG GC－3′）；SphK2（forward primer，5′－CAC CTG TGC TGG GTG CGG AG－3′；reverse primer，5′－GGC AGC CCA GGC TGA AGT GG－3′）and GAPDH（forward primer，5′－AGG AGT AAG AAA CCC TGG AC－3′；reverse primer，5′－CTG GGA TGG AAT TGT GAG－3′）。mRNA水平采用GAPDH校正。荧光强度的平均阈值用于分析其mRNA水平。mRNA的相对量采用ΔΔCt进行计算。

1.5 Western blot检测蛋白表达 肾脏组织匀浆经裂解提取蛋白后，经SDS－PAGE电泳分离后，转膜至PVDF。采用5%的脱脂牛奶室温封闭1h，将一抗、二抗孵育后，采用增强型的化学发光液检测条带信号。膜重孵鼠单抗α－tubulin作为内参对照。采用Quantity－One软件进行灰度分析。

1.6 鞘氨醇激酶活性测定 参考作者报道的方法进行SphK1活性的液质联用（LC－MS／MS）法检测［7］。30μg总蛋白液用于酶活性测定，反应采用2.5μL 200μM C17－Sph（溶于5%Triton X－100）和2.5μL 20mM ATP含 MgCl2（200mM），总体积50μL。37℃水浴反应20min后，用5μL 1MHCl和200μL氯仿∶甲醇∶浓盐酸（100∶200∶1，v／v）终止反应。然后加入10ng S1P作为内标。剧烈涡旋后，加入60μL氯仿和60μL 2MKCl，4℃，12 000g离心5min。下层的氯仿相转移到新的1.5mL离心管，室温真空干燥60min。挥干的残渣用100μL流动相（methanol：0.1%formic acid＝95∶5，v／v）重悬，然后剧烈涡旋1min。终溶液进样10μL进行液质联用（LC－MS／MS）（ThermoFinnigan）分析。

1.7 S1P含量测定 参照作者前期报道的方法［8］，用LCMS／MS法进行S1P定量分析。称量冰冻的肾脏组织样本20 mg，用400μL的蒸馏水进行电动匀浆。细胞则用PBS刮取下来，离心，并用100μL的PBS重悬，采用BCA法进行蛋白定量。S1P及相应的化合物采用甲醇沉淀抽提。混合液涡旋10 min后，4℃，12 000r／min离心5min，然后上清液转移至一干净的玻璃自动上样瓶中。每次进样10μL进行LC－MS／MS分析。

2 结 果

2.1 STZ诱导的糖尿病大鼠肾损伤 如表1所示，实验12周结束时，与正常对照组比较，糖尿病组大鼠的空腹血糖值显著升高（P＜0.01），糖尿病大鼠的肾重／体质量比与正常对照组比较显著增加（P＜0.05）。实验结束时糖尿病大鼠的24h尿蛋白明显增高（P＜0.05）。糖尿病大鼠的肾小球损伤表现为肾小球肥大和肾小球系膜细胞外基质积聚。与正常对照组相比，STZ诱导的糖尿病大鼠12周后出现明显的肾小球面积和系膜基质面积增大；肾小球内膜与肾小球囊发生粘连；并且PAS病理染色发现肾组织基质成分明显增多（图1），提示糖尿病大鼠12周后出现明显的肾脏肥大，肾小球硬化和肾功能受损。

2.2 糖尿病大鼠肾脏SphK1－S1P信号通路被激活 为了观察糖尿病状态下大鼠肾组织SphK1－S1P信号通路的变化，检测了正常对照组和糖尿病模型组大鼠肾组织的SphK1的表达及活性和S1P水平。采用Real－time PCR检测发现，糖尿病组大鼠肾脏SphK1mRNA水平是对照组的3倍，而SphK2mRNA水平没有变化（图2）。此外，免疫组织化学和Western blot检测发现糖尿病大鼠肾脏SphK1蛋白表达也有显著升高（图3）。LC－MS／MS实验结果表明，糖尿病大鼠肾脏SphK1活性显著增加（图4A）；并且S1P水平显著增加（图4B）。结果显示糖尿病状态下大鼠肾组织SphK1－S1P信号通路处于激活状态，与作者已报道的糖尿病小鼠模型实验结果一致［9］。糖尿病大小鼠模型实验结果均提示SphK1－S1P信号通路的激活可能参与了糖尿病肾损害的病理进程。

图1 STZ诱导的糖尿病大鼠肾脏系膜区基质分泌情况（PAS，×200）

图2 Real－time PCR检测糖尿病大鼠肾脏SphK1和SphK2mRNA水平

图3 SphK1在糖尿病肾脏组织中的表达

表1 血糖及肾功能指标检测

表1 血糖及肾功能指标检测

a：P＜0.05，b：P＜0.01，与对照组比较。

组别 血糖（mmol／L） 肾重／体质量（mg／g） 尿蛋白（mg／24h）对照组5.30±0.16 6.17±0.21 2.09±0.15糖尿病组 23.56±2.27b 18.23±0.72a 13.15±1.12a

图4 液质联用（LC－MS／MS）分别检测SphK1活性和S1P含量

3 讨 论

研究表明长期高血糖、糖基化终产物、氧化应激等可激活SphK1，进而导致S1P的生成增加［10］，促进肾小球系膜细胞增殖［11］等。肾脏纤维化是糖尿病肾病的主要病理特征之一，GMC是肾小球的主要功能细胞，无论在肾脏的生理功能还是病理变化中均发挥着重要的作用；现已认为GMC参与了糖尿病肾病、肾小球硬化的损伤过程［12］。糖尿病状态下，肾小球系膜细胞中细胞外基质的积聚，促进了肾脏纤维化的病理进程［13］。

本研究观察到糖尿病大鼠肾脏在SphK1－S1P信号通路的激活。本实验采用STZ诱导的糖尿病大鼠模型观察到SphK1－S1P信号通路与糖尿病肾病存在密切相关性。研究报道，在STZ诱导的大鼠4～5h后，其肾小球系膜细胞发生增殖，与此同时，SphK－S1P信号通路被激活［14－15］。并且，作者前期研究发现，在四氧嘧啶诱导12周的糖尿病小鼠，肾实质与肾功能明显受损，肾脏存在SphK－S1P信号通路的激活［9］。在本研究中，采用STZ诱导的12周糖尿病大鼠，肾脏亦明显损害，肾脏SphK1－S1P信号通路被激活。研究结果进一步提示，SphK1－S1P信号通路被体内高血糖激活后，可能参与了糖尿病肾损伤的病理进程。

综上所述，作者通过体内实验证实SphK1－S1P信号通路的激活可能参与了糖尿病肾损伤的病理进程。SphK1－S1P信号通路如何影响糖尿病肾病的进程有待进一步研究证明。本研究为进一步探明糖尿病肾病的病变机制、探索将SphK1－S1P信号通路作为抗糖尿病肾病的新的作用靶点提供了一定客观依据。

［1］Satirapoj B.Nephropathy in diabetes［J］.Adv Exp Med Biol，2012，771：107－122.

［2］Jiang Q，Liu P，Wu X，et al.Berberine attenuates lipopolysaccharide－induced extracelluar matrix accumulation and inflammation in rat mesangial cells：involvement of NF－kappaB signaling pathway［J］.Mol Cell Endocrinol，2011，331（1）：34－40.

［3］ Heffernan－Stroud LA，Obeid LM.Sphingosine kinase 1in cancer［J］.Adv Cancer Res，2013，117：201－235.

［4］ Li D，Zhang N，Cao Y，et al.Emodin ameliorates lipopolysaccharide－induced mastitis in mice by inhibiting activation of NF－kappaB and MAPKs signal pathways［J］.Eur J Pharmacol，2013，705（1－3）：79－85.

［5］ Rosa R，Marciano R，Malapelle U，et al.Sphingosine kinase 1overexpression contributes to cetuximab resistance in human colorectal cancer models［J］.Clin Cancer Res，2013，19（1）：138－147.

［6］ Meyer ZU，Heringdorf D，Jakobs KH.Renal mesangial cells：moving on sphingosine kinase－1［J］.Br J Pharmacol，2007，150（3）：255－257.

［7］ Lan T，Bi H，Xu S，et al.Determination of sphingosine kinase activity in biological samples by liquid chromatography－tandem mass spectrometry［J］.Biomed Chromatogr，2010，24（10）：1075－1083.

［8］ Lan T，Bi H，Liu W，et al.Simultaneous determination of sphingosine and sphingosine 1－phosphate in biological samples by liquid chromatography－tandem mass spectrometry［J］.J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2011，879（7－8）：520－526.

［9］ Lan T，Shen X，Liu P，et al.Berberine ameliorates renal injury in diabetic C57BL／6mice：Involvement of suppression of SphK－S1Psignaling pathway［J］.Arch Biochem Biophys，2010，502（2）：112－120.

［10］You B，Ren A，Yan G，et al.Activation of sphingosine kinase－1mediates inhibition of vascular smooth muscle cell apoptosis by hyperglycemia［J］.Diabetes，2007，56（5）：1445－1453.

［11］Klawitter S，Hofmann LP，Pfeilschifter J，et al.Extracellular nucleotides induce migration of renal mesangial cells by upregulating sphingosine kinase－1expression and activity［J］.Br J Pharmacol，2007，150（3）：271－280.

［12］Kolset SO，Reinholt FP，Jenssen T.Diabetic nephropathy and extracellular matrix［J］.J Histochem Cytochem，2012，60（12）：976－986.

［13］Thrailkill KM，Clay Bunn R，Fowlkes JL.Matrix metalloproteinases：their potential role in the pathogenesis of diabetic nephropathy［J］.Endocrine，2009，35（1）：1－10.

［14］Geoffroy K，Troncy L，Wiernsperger N，et al.Glomerular proliferation during early stages of diabetic nephropathy is associated with local increase of sphingosine－1－phosphate levels［J］.FEBS Lett，2005，579（5）：1249－1254.

［15］Liu W，Lan T，Xie X，et al.S1P2receptor mediates sphingosine－1－phosphate－induced fibronectin expression via MAPK signaling pathway in mesangial cells under high glucose condition［J］.Exp Cell Res，2012，318（8）：936－943.