任凌雁，何 燕，张 婷，王婵娟，王 欢，官志忠，单可人

（贵阳医学院分子生物学重点实验室，贵阳 550004）

贵州是一个多民族聚居的地区，有17个世居少数民族，其中苗族人口最多，占全国苗族总人口的50%左右。苗族人群线粒体DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）9bp序列缺失标记可能对追踪该民族人群的亲缘关系和迁移路线有所帮助。因为mtDNA 9bp缺失是一个非常有价值的多态性位点，其标准序列是2个串联重复的9bp序列（CCC CCT CTA）［1］，有3种突变型：长型（标准序列前有4个C加入），短型（仅有单拷贝9 bp序列，即9bp缺失），3型（有3拷贝9bp重复）［2］。研究发现，mtDNA 9bp缺失是亚洲人及起源于亚洲的人种的特征［3］，其缺失频率呈现的地理趋势能很好地与史前该地区人类迁移路线相符，现将贵州3个地域苗族人群131例男性的mtDNA 9bp缺失频率的检测分析结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 采集来自贵州从江岜沙、黔西沙井、威宁龙街等3个地域苗族人群131例男性个体血样，详见表1。所选对象均为当地健康居民，家系3代内为同一民族，彼此之间无亲缘关系。采样符合知情同意原则。血样均为EDTA－K2抗凝，－70℃暂存至提取基因组DNA。

1.2 DNA提取、定量及标化 按常规酚－氯仿法抽提基因组DNA，溶于TE；紫外吸收法定量后取少量统一标化浓度为50 ng／μL，－20℃保存备用。

1.3 mtDNA 9bp的PCR扩增及PAGE检测 依据mtDNA修订的剑桥标准序列（revised cambridge reference sequence，rCRS）［4］，用软件 Primer Premier5.0设计引物 P1／P2（序列见表2）进行PCR扩增。25μL PCR反应体系组成为：10×PCR buffer 2.5μL，25mmol／L MgCl21.5μL，4×dNTP（每种2.5 mmol／L）2.0μL，10μmol／L引物各0.4μL，DNA聚合酶1.0 U，模板DNA 50ng。PCR循环条件：94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，循环30次。PCR产物用10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，银染后观察结果。

表1 3个苗族人群样本概况

1.4 mtDNA 9bp分型结果测序验证 随机选取经PCRPAGE技术检测为标准型和9bp缺失短型的样本各5例，用引物P3／P4（序列见表2）进行PCR扩增，产物由北京鼎国昌盛生物技术公司完成序列测定。

2 结 果

2.1 PCR检测结果 经过PCR－PAGE检测，131例样本的PCR反应产物的电泳图谱中只检测到2种基因型，分别为109 bp和100bp（图1），分别对应标准型和9bp缺失的短型。

表2 引物序列及其他参数

图1 mtDNA regionⅤPCR产物的PAGE电泳图

2.2 序列测定结果 结果显示：标准型扩增产物的核苷酸序列与相对应的剑桥序列一致，即存在2个串联正向重复的9bp序列（CCC CCT CTA CCC CCT CTA），而9bp缺失短型扩增产物只有1个拷贝的9bp序列，即存在9bp缺失。见图2（A、B均为反向测序图）。

图2 mt DNA Region V区序列分析结果（反向测序）

2.3 mtDNA 9bp缺失频率 贵州岜沙、沙井、龙街3个地域苗族人群mtDNA 9bp缺失频率见表3。

表3 贵州3个地域苗族人群mtDNA 9bp缺失频率分布情况

3 讨 论

姚永刚等［5］对中国多民族群体的研究发现，其缺失频率由南向北、沿海向内陆呈现递减的梯度分布。不同地区不同民族的mtDNA 9bp缺失频率是各异的。本研究的3个苗族人群的缺失频率与台湾的高山族（41.46%）［5］相比较低，与广州汉族的缺失频率相近（20.8%）［6］，而较中原民族如河南汉族的缺失频率高（15.88%）［7］。北方的一些少数民族，如现代罗布人（8.3%）［8］、维吾尔族（3.3%）［9］、塔吉克族（1.43%）［10］缺失频率均比本研究的这3个民族低，差异经统计学分析已达到显著水平（χ2＝8.845，χ2＝9.499，χ2＝23.324，P＜0.05），同一地区的不同民族其mtDNA 9bp缺失频率是有区别的，如前期本课题研究贵州地区蒙古族（9.6%）、羌族（7.7%）［11］都低于本研究，并且差异有统计学意义（χ2＝8.280，χ2＝10.094，P＜0.05），水族［12］与本研究的苗族平均缺失率相近，而瑶族的缺失频率高达58.2%［13］，高于本文的苗族平均缺失频率，差异有统计学意义（χ2＝17.972，P＜0.05）；不同地区的同一民族其mtDNA 9bp缺失频率也各异，广西苗族缺失频率为33.01%［14］，高于本研究，但差异无统计学意义。而贵州不同地区的苗族缺失频率也是有所差别，本文3个地区的苗族缺失频率就有所差异，其中从江岜沙苗族与黔西沙井苗族的差异有统计学意义（χ2＝5.623，P＜0.05）。苗族历史悠久，由于战争、政治、经济等原因，历史上曾经历过大幅度、远距离、长时期的迁徙。自秦、汉时期有苗族先民进入贵州，经过唐、宋、元、明、清千余年的流动和迁徙，苗族的分布初步形成了今天的格局［15］。世居苗族主要分布在黔、湘、滇、川、桂、鄂、渝等10个省区，而贵州省已成为苗族的主要聚居区，人口占全国苗族总人口数的51.3%，是全省少数民族中人口最多的民族。苗族有自己的语言，属汉藏语系苗瑶语族苗语支。苗语分3大方言，即东部方言、中部方言、西部方言。不同方言的人，语言互不相通。贵州从江属中部方言的南部土语分支，贵州黔西属西部方言川黔滇次方言，贵州威宁属西部方言滇东北次方言，因此方言的隔离可能导致遗传结构有所差异。此外，从江县所在的黔东南苗族侗族自治州有众多的苗族、壮族，而贵州的少数民族有着大杂居、小聚居的特点，所以从江苗族与黔西苗族、威宁苗族有差异，并且与黔西苗族的差异有统计学意义，推测可能是黔东南苗族与本课题前期研究的当地侗族（13.54%）（数据另行报道）有基因交流所致。总之，本次对贵州苗族人群mtDNA 9bp缺失频率的研究有助于贵州苗族人群遗传结构的组成，并进一步为贵州苗族的起源、迁徙过程奠定基础。

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