陕西中医学院第二附属医院 （咸阳712000） 李 宏 田亚宁 董昌虎梁 漫 王 蕾 齐 婧 仝航斌 周智辉

目前，随着分子生物学技术的快速发展，PCR技术广泛应用于医学研究领域，除在科研方面的贡献巨大之外，对于临床疾病的诊断和预后评估方面具有重要的应用价值。本文着重从PCR反应体系的1个关键因素：Taq DNA聚合酶含量进行实验研究，寻求最佳的Taq DNA聚合酶PCR反应条件。Taq DNA聚合酶是 Mg2＋依赖性酶，因而对 Mg2＋的浓度最为敏感，在PCR反应中耐热DNA聚合酶的活性与反应体系中游离Mg2＋浓度直接相关，反应体系中Mg2＋浓度低时，酶的活力显著降低；过高时，酶则催化非特异性扩增。因此，在固定其他因素的前提下，探讨两者最佳作用浓度，从而提高Taq DNA聚合酶的作用效力，以获得理想的目的基因的扩增片断。

材料与方法

1 材 料 实验标本：收集50份正常人的静脉血，EDTA抗凝。主要仪器及设备：低温冰箱、低温超速离心机、PCR扩增仪、凝胶成像系统。主要试剂：Taq DNA聚合酶（MBI），Marker（100bp－1500bp，广州东胜），25 m M MgCl2（MBI），琼脂糖（Spanish Specifications）。

2 方 法 ①DNA的提取：采用经典的酚－氯仿－异戊醇法：在室温下融化血液，混匀后吸取0．6 ml至离心管中，加入3～5倍体积的红细胞裂解液（含KHCO3、 NH4Cl、EDTA－Na2），轻柔混匀，冰中放置30 min，中间上下颠倒，轻柔混匀数次。5000rp m 10 min，弃上清收集细胞。加入1 ml红细胞裂解液，混匀，冰中静置10 min。5000r p m 10 min，弃上清收集细胞。重复前两步，直到沉淀中肉眼可见之红色。用150μl的 白 细 胞 裂 解 （含 10 m MTris－Cl p H－8．0，100 m M Na Cl，10 m MEDTA，0．5%SDS，0．1 mg/ml蛋白酶K）液悬浮沉淀，置于37℃水浴中过夜。加入等体积的饱和酚，充分混匀，以12000r/min离心10 min，将上清液移至另一EP管中。加入等体积的氯仿：异戊 醇 （24 ∶ 1）［1］，充 分 混 匀，以 12000r/min 离 心10 min。……