杜 鹃(吉林医药学院，吉林 吉林 132013)

莴苣(Lettuce)，又称千金菜、石苣，一、二年生草本植物。《本草纲目》记载，莴笋性凉味苦，有利五脏、通经脉、开胸膈、坚筋骨、白牙齿、去口气、通乳汁、利小便等功效［1］。目前，对莴苣的研究还主要集中在提取纯化工艺上，对莴苣黄酮(total flavonoid extracts from lettuce，TFEL)体外抗氧化活性的研究尚未见报道。本研究旨在通过体外氧化化学模拟体系来研究TFEL的抗氧化活性，以期为莴苣天然抗氧化剂的开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 仪器、材料和试剂

EA-500A型高速中药粉碎机(长沙岳麓中南药机械厂);RE-52AA型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);UV1800紫外可见分光光度计(日本岛津);TGL20M-2台式高速大容量冷冻离心机(湖南凯达实业发展有限公司);202-1型电热恒温干燥箱(天津市泰斯特仪器有限公司)。

莴苣:购自吉林市多客源超市;芦丁标准品(中国药品生物制品检定所);2-D-脱氧核糖(Sigma公司);无水乙醇、乙醚、硫酸亚铁、氯化钠、抗坏血酸、三羟甲基氨基甲烷等试剂均为国产分析纯。

实验动物为雄性昆明小鼠10只，由吉林医药学院动物实验中心提供，体重(20±2)g。

1.2 莴苣预处理

取新鲜莴苣样品，清洗后蒸馏水冲洗，切片后微波处理3 min，60℃干燥24 h，中药粉碎机中粉碎至呈粉末，过60目筛，45℃乙醚脱脂脱色2 h(索氏提取法)，自然风干。

1.3 莴苣黄酮类化合物的提取

称取10 mg芦丁标准样品，用70%乙醇定容至50 mL，摇匀即得浓度为0.2 mg/mL标准样品储备液。取芦丁标准溶液2.0 mL，70%乙醇定容至10 mL，用紫外可见分光光度计于190～500 nm范围内进行吸光度扫描，2次扫描取平均值，最大特征吸收峰为360 nm。分别移取0.0、0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 mL芦丁标准样品储备液于6个10 mL容量瓶中，加入体积分数70%的乙醇溶液定容，在360 nm处测定吸光度值。得回归方程为Y=36.121 4X+0.546 6，R=0.999 9(X:浓度，Y:吸光度)。

超声提取:称取2.0 g脱脂后莴苣样品于三角烧瓶中，按料液比1∶20加入60%乙醇溶液，50℃下利用50 W功率的超声波提取30 min，离心10 min(3 000 r/min)，上清液即为总黄酮提取液。提取液减压浓缩至干后以60%乙醇定容至50 mL，稀释20倍，于360 nm处测定吸光度值，并按下列公式计算提取物中总黄酮的含量。

经计算，莴苣总黄酮含量为0.74%。

1.4 TFEL清除羟自由基作用测定

样品组:取5支试管分别加入5 mmol/L FeSO4，5 mmol/L EDTA，5 mmol/L 2-D-脱氧核糖各0.2 mL，与0.2 mL浓度分别为10、20、50、100、150 mg/mL的TFEL样品液混合，加入0.1 mol/L PBS缓冲液(pH 7.4)1.0 mL，0.2 mL的5 mmol/L过氧化氢(H2O2)，37℃水浴4 h，加入1.4%三氯乙酸、0.5%硫代巴比妥酸各1 mL。沸水浴10 min后迅速冷却至室温。于波长532 nm处测定各管的吸光度值。空白组:不加2-D-脱氧核糖，其余同样品管。对照组:用相同体积的60%乙醇代替样品液，其余同样品管。以吸光度计算抑制率。

1.5 TFEL对H2O2诱导肝匀浆脂质过氧化的影响

取小鼠肝脏组织，冷生理盐水清洗，冰浴下匀浆，制成1%肝组织匀浆。取1%肝匀浆2 mL，分别加入浓度为5、10、20、50和100 mg/mL TFEL溶液0.4 mL，再 依 次 加 入6mmol/L FeSO40.2 mL，60 mmol/L H2O20.2 mL，37℃温育1 h后，加入15%三氯乙酸2.0 mL，终止反应，以3 000 r/min离心10 min，取上清液，加0.67%硫代巴比妥酸2.0 mL，沸水浴15 min，流水冷却，测定532 nm处的吸光度值;对照组:用等体积60%乙醇代替样品液;VC阳性对照组:用等体积等浓度的VC溶液代替样品液［2］。

1.6 TFEL对H2 O2所致的红细胞氧化溶血的影响

小鼠眼球取血，肝素抗凝。用0.9%的生理盐水冲洗、离心3次，2 000 r/min离心10 min。直至上清液无红色，用0.9%的生理盐水配制成0.5%红细胞悬液。取1mL红细胞悬浮液，分别加入0.2 mL浓度为2、5、10、20和50 mg/mL的TFEL样品溶液，混匀，加入0.1 mL 100 mmol/L H2O2溶液，混匀，37℃温育1 h后，2 000 r/min离心10 min，用生理盐水稀释4倍，取上清液，以生理盐水调零，于415 nm处测定吸光度;VC阳性对照组:用等体积等浓度的VC溶液代替样品液;H2O2诱导对照组:用等体积的生理盐水代替样品液。

2 结果与讨论

2.1 TFEL清除·OH作用

结果显示(见图1)，当TFEL提取物在20～100 mg/mL浓度范围内时，随浓度的增加，对·OH的抑制率明显增强;但当TFEL浓度大于100 mg/mL后，其抑制率增加不明显。经计算TFEL对·OH半数抑制浓度IC50为59.06 mg/mL。

2.2 TFEL对H2O2诱导肝匀浆脂质过氧化的影响

结果显示(见图2)，在试验浓度范围内，各试样的抑制作用随浓度的增加而逐渐增大，表现一定的量效关系。经计算TFEL对H2O2诱导肝匀浆脂质过氧化半数抑制浓度IC 50为6.986 mg/mL。在同浓度下，TFEL样品的抑制率略大于VC溶液。

2.3 TFEL对H2 O2所致的红细胞氧化溶血的影响

由图3可知，当TFEL提取物的浓度在5～50 mg/mL之间时，对红细胞溶血有明显的抑制作用，且随着浓度增加，抑制率明显提高;当黄酮浓度达到50 mg/mL时，抑制率可达96.03%。经计算TFEL对H2O2所致红细胞氧化溶血的半数抑制浓度IC50为20.25 mg/mL。

3 结论

莴苣中含有较多的黄酮类物质，能有效清除羟自由基，抑制肝脏组织中脂质过氧化产物丙二醛的产生，对H2O2所致的红细胞氧化溶血有明显的抑制作用。表明TFEL具有较强的体外抗氧化活性，作为天然抗氧化剂具有很好的开发潜力，在食品、医药领域有广泛的应用前景，有待进一步研究开发。

图1 TFEL对·OH的清除作用

图2 TFEL对肝匀浆脂质过氧化的影响

图3 TFEL对红细胞氧化溶血的影响

［1］ 陈静波，田迪英.莴笋不同部位抗氧化活性的研究［J］.食品研究与开发，2006，27(9):54-57.

［2］ 张 岚，葛红娟，温武略，等.酸浆宿萼总黄酮体外对羟基自由基的抑制作用［J］.时珍国医国药，2011，22(8):1936-1937.