朱 剑综述，林冬静审校 (吉林医药学院:.200级临床医学本科乙班;2.组胚教研室，吉林 吉林3203)

1 造血干细胞的发现

Till等［1］(1961年)应用脾集落法首次证明造血干细胞(hematopoietic stem cell，HSC)的存在。我国学者吴祖泽等分别制备正常雄性和雌性小鼠骨髓细胞悬液，将含等量的雄性小鼠的骨髓细胞悬液输入经照射的同系小鼠静脉内，13 d后，切取受体鼠的脾集落做染色体分析。结果发现，在一个脾集落中不存在兼有雄性和雌性染色体的细胞，有力证实每个脾集落都是由单一细胞增殖分化而成的。白血病患者的骨髓细胞染色体分析证明人造血组织中也存在HSC，这又为其存在提供了直接的证据。HSC以及低数量存在于哺乳动物的胎肝、脐血以及骨髓中，被称作“龛(niche)”的特定微环境所包围。HSC在整个生命过程中控制着造血系统生成淋系、髓系细胞，对各种血细胞的更新起着决定性作用［2］。

2 HSC是干细胞生物学的范例

血液的产生对于生命是必不可少的，因为它们在组织的氧合作用、血管完整性的控制和感染后免疫应答细胞的分布中扮演了重要角色，而且大量的细胞数和相对短的细胞周期要求应当不断产生新的细胞代替活动期细胞。血细胞稳定的日生产率是启动造血过程的干细胞潜能的体现［3］。这些对增殖和分化的极大需求及在人类长期成功移植的现实，使HSC在各类细胞治疗中成为首选的细胞类型。

3 造血原理

由HSC定向分化，增殖为不同的细胞系，并进一步生成血细胞。人类HSC首先出现于胚龄2～3周的卵黄囊，在胚胎早期(第2～3月)牵制肝、脾，第5个月又从肝脾迁至骨髓。在胚胎末期一直到出生后，骨髓成为HSC的主要来源［4］。具有多潜能性，即具有自身复制和分化两种功能。在胚胎和迅速再生的骨髓中，HSC多处于骨髓增殖中，而在正常骨髓中，则多数处于静止期(G0期)，当机体需要时，其中一部分发育成不同血细胞系的定向干细胞。定向干细胞多数处于增殖之中，并进一步分化为各系统的血细胞系，如红细胞系、粒细胞系、单核-吞噬细胞系、巨核细胞系以及淋巴细胞系［5］。由HSC分化出来的淋巴细胞有两个发育途径:一个受胸腺的作用，在胸腺素的催化作用下分化成熟为胸腺依赖性淋巴细胞，即T细胞;另一个不受胸腺，而受腔上囊(鸟类)或类囊器官(哺乳动物)的影响，分化成熟为囊依赖性淋巴细胞或骨髓依赖性淋巴细胞，即B细胞。由T、B细胞分别引起细胞免疫和体液免疫。

4 HSC鉴定分类

HSC的鉴定是建立在一系列小鼠实验基础上的，该标准也适用于人体内的HSC。根据其自我更新和分化产生体内的各种血细胞的能力而定义的。

若干年来，许多表面标记物常被用来鉴别、分离和纯化从骨髓和血液中提取的HSC。未分化的HSC和造血前体细胞的表达c-kit、CD43和H-2K;为移植所需，表达CD34、Thy1+、Lin-的细胞含有干细胞可能性更大，更容易移植成功。

根据其造血重建能力可以分为长期增殖造血干细胞(long-term hematopoietic stem cell，LT-HSC)和短期增殖造血干细胞(short-term hematopoietic stem cell，ST-HSC)［6］。ST-HSC只在有限时间内分裂，有的只分裂几个月。LT-HSC有很高的端粒酶活性。端粒酶能通过给染色体末端的端粒加入核苷酸而保持端粒的长度。高端粒酶活性是未分化的分裂期细胞和肿瘤细胞的特征之一。已分化的人类体细胞并无端粒酶活性。LT-HSC存在与成人的骨髓、血液、肝脏和脾脏中，但数量非常稀少。在小鼠中10 000～15 000个骨髓细胞中才有1个LT-HSC。最近有研究表明，ST-HSC实际上是一个能自我更新、重组造血系统的混合细胞群［7］。

HSC继续向下分化形成多能造血祖细胞(multipotent progenitor cells，MPPs)，MPPs再分化形成髓系祖细胞(common myeloid progenitor，CMP)和淋系祖细胞(common lymphoid progenitor，CLP)［8-9］。髓系前体细胞能分化为单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、巨核细胞和红细胞;淋巴前体细胞能分化为T细胞、B细胞和自然杀伤细胞，其分化机制及通道仍在研究中。

5 HSC形态学特点

经光镜、电镜观察，提出HSC大小形态类似小淋巴细胞，直径7～10μm，有少量的胞浆，除游离核糖体和少量线粒体外，无其他细胞器，过氧化物酶染色阴性。与淋巴细胞相比较，发现HSC:①大小变动范围较淋巴细胞大，细胞核大致呈圆形，多不规则，凹陷不如淋巴细胞的深;②核的染色质与小淋巴细胞比较，细小、弥散分布;③可见到小淋巴细胞胞浆中常见到的高尔基复合体、内质网和溶酶体;④虽然两种细胞内线粒体均少，但HSC的线粒体较淋巴细胞的多且小;⑤含游离核糖体较小淋巴细胞多，但极少有多聚核糖体［10］。

6 HSC生物学特性

高度自我复制能力。经分裂增生产生的子代细胞均保持亲代细胞的所有特征，机体内干细胞的这种自我复制能力持续终身。关于干细胞分裂的机制可能与细胞极性有关。

多分化能力。具有多分化潜能，生成大量成熟的各种血细胞，还可生成一些其他细胞，如破骨细胞、巨噬细胞和肥大细胞等。

细胞的不均一性。不是单一的细胞群体，而是有不同发育等级的干细胞组成［11］。

7 HSC检测方法

由于HSC数量极少，且从形态上不能识别，在实验血液发展早期也没有发现造血干细胞的表面识别标志(CD34)，更不具备分离、纯化HSC的手段，故经典的研究其性能的思路为选择一个HSC上的人为或天然的具有遗传特性的标志，通过检测分化后细胞的这一标志来推测它的性能。早期采用的标志是由辐射诱变的染色体以外及天然的性染色体(小鼠)。前者是指采用带有畸变染色体标志的小鼠骨髓去重建受致死剂量射线小鼠的造血，通过研究带有这一染色体标志重建造血以后的小鼠细胞情况来推测HSC的性能。而后者是指采用一种性别的小鼠HSC去重建相反性别的受射线照射小鼠的造血，再研究造血重建后的血细胞的染色体核型，以此推测造血干细胞的性能［12］。其方法有:①经典测试方法;②自我更新和造血重建能力的测试;③无限增殖及多向分化能力的测试;④胎羊宫内移植模型;⑤竞争性再植实验;⑥体外克隆实验。目前用来检测HSC和早期造血祖细胞的体外克隆实验包括:长期培养启动细胞LIC-IC实验;延长的长期培养启动细胞LIC-IC实验;高增殖潜能集落形成细胞实验HPP-CFC;卵石样区域形成细胞实验CAFC;原始细胞集落形成细胞测试CFC-BI;混合集落培养法CFU-Mix［2］。

8 HSC临床应用

8.1 基因治疗

HSC因具有自我更新、多向分化、重建长期造血、采集和体外处理容易等特点而成为某些疾病基因治疗的一种理想靶细胞［13］。造血干细胞应用范围比较广泛［14］:①单基因缺陷遗传病，如重症联合免疫缺陷症(SCID)、Fanconi贫血等;②移植与肿瘤治疗中基因标记、自杀基因或耐药基因的导入;③DNA/RNA疫苗;④AIDS的治疗，如HIV基因抑制物等。

8.2 细胞治疗

(1)临床HSC移植。临床进行造血干细胞移植(hematopoietic stem cell transplantation，HSCT)，通过注入定向造血干细胞及化学放射治疗来消除以前存在的骨髓再生，是由E.Donnall Thomas在1956年首次完成［15］。到1995年，已在世界各地进行了40 000例造血干细胞移植。截至2009年9月，全球共有2 723项干细胞相关的临床研究已开展或者正在进行［16］。其中，Ⅰ期临床研究817项，Ⅱ期临床研究1 421项，Ⅲ期临床研究370项，Ⅳ期临床研究62项。1 311项临床研究正在招募志愿者。开展干细胞临床研究的国家主要在美国和欧洲(根据NIH的临床研究区域分类)。此外，加拿大、澳大利亚的干细胞临床研究也比较多，而亚洲地区相对较少。在这些临床研究中，血液和淋巴疾病干细胞治疗较多。

(2)移植种类、适应证及其预后。

当前执行干细胞移植的种类有以下几种:自体干细胞移植;异体干细胞移植、骨髓根除相关干细胞移植;错配、亲缘(单倍同一性)、非亲缘;脐带;异体移植，非骨髓根除相关或不相关、匹配或不匹配［15］。自体HSCT是患者提供他们自己的干细胞(骨髓、外周血或脐带血)，因此能避免移植抗宿主病。提前获得材料的自体HSCT可允许化疗和放疗的剂量增加超过骨髓抑制的限度。高剂量治疗实施后，受体被自体干细胞“挽救”。

适应证包括浆细胞性骨髓瘤和所有种类复发性淋巴瘤。同源性HSCT也与之相似，其干细胞从同卵双生同胞身上获取。异体HSCT中供体细胞在重建造血作用的同时，也产生了免疫介导的移植物抗肿瘤(graft versus tumor，GVT)作用，与自体移植相比能减少复发率［17］。异体干细胞移植可取自亲缘或非亲缘的供体。供体和受体可接受的匹配程度与主要组织相容性/人类白细胞抗原(human lymphocyte antigen，HLA)位点相关，其发生作用与干细胞源、受体的年龄及其他因素相关。脐带血更能接受各种不匹配的人类白细胞抗原，这是外周血和骨髓移植所不能的。

由于造血干细胞移植时供体T细胞输注引发移植物抗宿主病(graft versus host disease，GVHD)。抗宿主病可以导致急性症状和致命的细胞因子反应，但是更常见的表现是易变且反复的皮疹、黏膜炎和炎症改变，长期后遗症(慢性GVHD)包括血管病和终末器官损伤［18-19］。表1显示了国际骨髓移植登记处(IBMTR)对急性GVDH分级标准［20］。

造血干细胞基因治疗尚处于探索阶段，有许多问题需要解决:如生物安全性问题，已经发现由于随机整合引起插入突变，进而出现白血病［21］;还有转染效率低，外源基因不能长期稳定地表达或“沉默”现象，严重影响临床应用。不过，随着对造血干细胞生物学特性的深入研究，以及生物技术手段的不断创新，使造血干细胞的细胞治疗和基因治疗成为广阔的治疗手段。

表1 急性GVHD的IBMTR分度标准

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