霍 毅，李名汉泽，尹彬彬，邵国杰，侯毅鞠 (吉林医药学院，吉林 吉林 132013)

大蒜素为大蒜鳞茎中的一种含硫化合物，具有抗菌消炎、提高机体免疫力等多种药理作用，目前作为抗菌药物而广泛应用到临床。近年来大蒜素在抗肿瘤方面的作用也逐渐引起人们的重视。研究发现大蒜素对胃癌、大肠癌、前列腺癌、乳腺癌等多种肿瘤产生预防或治疗作用［1］。普通抗癌药物在杀伤肿瘤细胞的同时也杀伤正常细胞，理想的抗癌药物是最大限度的杀伤肿瘤细胞的同时对正常细胞的毒性较小。大蒜素是一种天然的抗癌药物，能杀伤肿瘤细胞而对正常细胞毒性小［2］。大蒜素既可以单独使用，也可以和放疗、化疗等治疗方法联合使用［3］。本试验旨在探讨大蒜素对K562细胞增殖、诱导凋亡的影响，为其在临床应用于白血病的治疗提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 材 料

大蒜素注射液(购自安徽华源医药有限公司);K562细胞为吉林医药学院检验学院细胞室冻存细胞;RPMI-1640培养基(购自美国GIBCO公司);超级新生牛血清(购自杭州四季青生物工程材料有限公司);MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒(购自武汉博士德生物工程有限公司)。

1.2 细胞培养

K562细胞于含10%超级新生牛血清的RPMI-1640完全培养液中生长，37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养，取对数生长期细胞用于试验。

1.3 细胞生长状态的观察

常规培养K562细胞至对数生长期，将对数生长期细胞分成5组，以每孔104接种于96孔板中，12 h后分别加入大蒜素，使终浓度分别为5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL，并设置对照组，培养48 h后于倒置显微镜下观察细胞状态并照相。

1.4 瑞氏染色观察

常规培养K562细胞至对数生长期，将对数生长期细胞分成5组，12 h后分别加入大蒜素使终浓度分别为5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL，并设置对照组，培养48 h后收集各组细胞，离心800 r/min，5 min，弃上清，将细胞沉淀涂布于载玻片上，丙酮固定10 min后取出，PBS冲洗，自然晾干，滴加瑞氏染液1 min后再加入等量的PBS，混匀，静置5 min后，水洗，吸干，镜检观察并照相。

1.5 MTT法检测

取对数生长期K562细胞制成细胞悬液，浓度为105/mL，接种于96孔板内，每孔100μL，加入不同浓度的大蒜素使终浓度分别为5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL，每一浓度均设4个复孔，并设置对照孔及调零孔，分别在加药24 h、48h、72h后加入MTT溶液10μL，37℃继续培养4 h，终止培养，离心1 000 r/min，5 min，弃去孔内培养液，每孔加入100μL Formazan溶解液，振荡10 min，用酶联免疫检测仪在570 nm波长下测各孔吸光度，按下列公式计算抑制率，IR%=(1-试验组平均A值/对照组平均A值)×100%。

2 结果

2.1 大蒜素对K562细胞生长状态的影响

对照组细胞体积大，多呈圆形，常聚集成团如葡萄串样，胞浆内未见颗粒。试验组随着大蒜素浓度的逐渐升高，细胞减少，部分细胞胞膜破裂，凋亡的K562细胞逐渐增多且明显。部分细胞呈现典型的凋亡形态学改变:细胞分散，体积缩小，但细胞膜完整并可见凋亡小体和细胞碎屑。随着作用时间的延长，高浓度大蒜素组(40μg/mL)主要表现为细胞坏死，见图1。

图1 K562细胞生长状态(40×)

2.2 瑞氏染色观察

瑞氏染色后，对照组K562细胞核圆形或椭圆形，核浆比例大。经大蒜素作用后的K562细胞出现退行性变，细胞体积变小，胞质浓染，结构模糊，边缘不清晰，核浆比例减小，核固缩、深染，核膜消失，细胞核断裂成小块或碎片状，并且可观察到细胞中出现空泡和凋亡小体，见图2。

2.3 大蒜素对K562细胞的生长抑制作用

MTT法结果表明，K562细胞的增殖抑制率与大蒜素作用的浓度与时间有明显依赖关系，即随着大蒜素浓度的逐渐升高和作用时间的逐渐延长，K562细胞的生长受到明显抑制，见图3。

图2 K562细胞瑞氏染色结果(100×)

图3 不同浓度的大蒜素对K562细胞的抑制作用

3 讨论

红白血病是一种少见的异质性血液系统恶性肿瘤，起源于多能干细胞，可以同时累及多个细胞系，临床预后较差［4］。大蒜素中含有的硫化物、微量元素、超氧化物歧化酶等一些特殊的生物活性物质使大蒜素具有广泛的药效，尤其具有良好的抗菌消炎和抗肿瘤的作用［5］。近年来国内外的流行病学调查表明，大蒜素对胃癌、结肠癌、白血病等多种肿瘤均有抑制作用［6］。研究表明，大蒜素主要通过抑制肿瘤细胞增殖、直接杀伤肿瘤细胞、诱导肿瘤细胞凋亡、阻滞细胞周期于G1/S期和G2/M期、增强化疗药物的敏感性以及提高机体的免疫力来发挥抗肿瘤作用［7-9］。

本研究以人红白血病K562细胞为靶细胞进行大蒜素的抗肿瘤效应研究，采用形态学观察、瑞氏染色、MTT比色分析法检测大蒜素对K562细胞的增殖抑制和凋亡诱导作用。结果显示K562细胞经大蒜素处理后，试验组与对照组相比，细胞明显减少、分散，体积缩小，胞浆浓缩，颗粒增多;经瑞氏染色后，胞质浓染，结构模糊，边缘不清晰，核固缩、深染，可见凋亡小体和细胞碎屑，胞浆中出现空泡。MTT比色法证实大蒜素对体外培养的K562细胞有明显的生长抑制作用，且具有剂量和时间依赖性，即随着大蒜素浓度的升高和作用时间的延长，K562细胞存活率降低，抑制率显著升高。综上所述，大蒜素对K562细胞有生长抑制作用，能诱导K562细胞凋亡。

近年来白血病发病率呈上升趋势，目前对白血病的治疗主要是强效化疗，然而化疗药物在杀伤白血病细胞的同时也杀伤骨髓中正常的造血干祖细胞，导致骨髓抑制与粒细胞缺乏而发生各种严重感染［6］。由于耐药性增加，副作用明显，用药效果差，最终使化疗无效。因此开发一种高效低毒的抗癌新药对白血病的临床治疗意义重大。本试验通过大蒜素在体外抑制K562细胞生长并诱导凋亡的研究发现，大蒜素不仅具有抗肿瘤效应，还具有天然安全的特点，可用于白血病患者的辅助治疗，具有良好的开发应用前景，为进入临床应用奠定基础。

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