王 瑛，张本印，牛江进，张 琳，陶燕铎，梅丽娟，王启兰，*

（1.中国科学院西北高原生物研究所，青海西宁 810008；2.中国科学院研究生院，北京 100049）

乳白香青（Anaphalis lactea Maxim.）属菊科香青属多年生草本植物，主要分布于青海东部、甘肃南部及四川西北部，为常用藏药，全草用药，具有活血散瘀、祛风湿、消痞瘤、平肝潜阳、祛痰、平喘及外用止血、治风寒感冒、胃溃疡等功效[1-4]。绿原酸是乳白香青中主要的生物活性物质之一，化学名称为3-咖啡酰奎尼酸，分子式为C16H18O9[5]。绿原酸具有较强的生理活性，如抗肿瘤、抗氧化[6-8]、抗病毒[9]、消炎[10]、解毒、利胆、降压降血脂和升高白细胞及显著增加胃肠蠕动和促进胃液分泌等药理作用[11-13]，对大肠杆菌、金色葡萄球菌、肺炎球菌和病毒有较强的抑制作用[14-15]。绿原酸作为极具生物活性的天然物质，目前已被广泛应用于医药、食品、日化等行业。我国虽然拥有富含绿原酸的金花、杜仲等丰富的自然资源，国内外对绿原酸的需求仍然较大。但截至目前，国内外文献还没有对乳白香青中绿原酸提取工艺研究报道。鉴于响应面法在优化反应条件、研究各因素之间相互作用的过程中具有直观、简便的特点，如张崟等[16]就响应面法与正交实验对骨素酶解工艺做了对比，结果发现响应面法得出的最优工艺所得的水解度比正交实验得出的最优工艺所得水解度高出15.4%。将响应面法用于乳白香青绿原酸提取工艺的优化和结果分析，对开发和利用乳白香青资源有重要意义。本研究在单因素实验的基础上选择提取温度、液料比、甲醇百分含量3个主要因素，用绿原酸标准品HPLC法绘制标准曲线，以绿原酸得率为指标，采用响应面法对乳白香青中绿原酸提取工艺进行了优化。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

乳白香青 2011年8月采自青海省门源县仙米林场（N37°23’～37°50’，E101°46’～102°39’之间），经中国科学院西北高原生研究所梅丽娟高级工程师鉴定为乳白香青（Anaphalis lactea Maxim.）；绿原酸标准品 购自中国药品生物制品检定所；试剂 除高效色谱流动相用色谱纯外，其余均为分析纯；色谱用水 超纯水。

Agilent 1200型液相色谱仪 美国安捷伦仪器有限公司；XS105DU型电子天平 瑞士梅特勒托利多；DFY－300型高速万能粉碎机 温岭市林大机械有限公司；HH－6型数显恒温水浴锅 国华电器有限公司；UPT－Ⅰ－57型优普超纯水机 成都超纯水科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 材料预处理 将乳白香青置于通风避光处阴干至恒重，用中药粉碎机粉碎成细粉，过八十目筛，备用。

1.2.2 色谱条件 色谱柱为Phenomenex ODS（150.0mm×4.6mm，35μm）色谱柱；流动相为乙腈－0.3%磷酸（13∶87，V/V）；检测波长为327nm；柱温为25℃；流速为1.0mL/min；进样量为10μL。

1.2.3 绿原酸标准曲线的绘制 精密称取绿原酸对照品2.4mg，置于10mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容，得0.24mg/mL的对照品储备液。在液相中绿原酸标准品进样量分别为5、8、10μL，以绿原酸标准品的质量为纵坐标，以峰面积为横坐标绘制标准曲线。计算得线性回归方程为：y=0.0004x－0.0088，r=0.9998，如图1所示。结果表明，峰面积与绿原酸标准品的质量线性关系良好。绿原酸对照品色谱图及乳白香青样品色谱图如图2所示。

1.2.4 单因素实验设计 在进行响应面分析之前，先通过单因素实验选出对乳白香青绿原酸提取得率有影响的因素，并确定其实验水平。参考相关文献，本文称取1.00g乳白香青粉末，考察了不同的液料比（10∶1～50∶1）、提取温度（30～90℃）、甲醇提取浓度（45～95%）、超声时间（5～30min）对绿原酸提取得率的影响。

1.2.5 响应面法实验设计与数据分析方法 根据Box－Benhnken实验设计原理，选择影响乳白香青绿原酸得率（Y）的3个主要影响因素：提取温度（A）、液料比（B）、甲醇浓度（C）进行组合。以－1、0、1代表自变量水平，xi为自变量的编码值；Xi为自变量的真实值；其关系为xi=（Xi－X0）/ΔX。其中，X0为实验中心点处自变量的真实值；ΔX为自变量的变化步长[17]。实验因素及水平编码见表1。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 液料比对绿原酸提取率的影响 设定甲醇浓度为70%，提取温度为50℃，考察液料比对绿原酸提取率的影响。设计液料比为10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1。结果如图3所示。当料液比为30∶1时，绿原酸提取得率基本不再增加。再增加液料比，绿原酸提取得率基本稳定，但同时会增加生产成本。

2.1.2 提取温度对绿原酸提取率的影响 设定液料比20∶1，乙醇体积分数为70%，考察提取温度对绿原酸提取率的影响。设计提取温度为30、40、50、60、70、80、90℃。结果如图4所示，绿原酸提取率温度升高而增加，当温度升高至时40℃，绿原酸提取得率最高；40～60℃时绿原酸提取率平稳；随后提取率急剧降低。

2.1.3 甲醇浓度对乳白香青中绿原酸提取率的影响设定液料比20∶1，提取温度50℃，考察甲醇浓度对绿原酸提取率的影响。设计甲醇体积分数为45%、55%、65%、75%、85%、95%，结果如图5所示。绿原酸提取率随甲醇浓度增加而增加，当甲醇体积分数为65%时，绿原酸提取率最高，甲醇浓度大于65%时，绿原酸提取得率下降。

2.2 响应面法实验数据分析

对乳白香青中绿原酸提取工艺进行响应面分析，其具体实验方案及结果见表2，方差分析结果见表3。

采用Design-Expert 8.05软件对各因素进行回归拟合，得到绿原酸得率回归方程：

Y=5.26+0.18A+0.38B+0.17C+0.094AB+0.13AC+0.23BC-0.46A2-0.54B2-0.48C2-0.080A2B。

模型的可靠性可从方差分析及相关系数来考察（见表3）。结果表明对绿原酸提取量所建立的二次多项模型具有显著性。因而该模型拟合程度比较好，实验误差小，可以用此模型对甲醇提取乳白香青中绿原酸的提取量进行分析和预测。模型方程回归系数及其显著性检验（见表3）。结果表明，一次项A、C显著，B极显著；二次项A2、B2和C2极显著；交互项AB、AC不显著，BC显著。

2.3 响应面分析和因素间的交互影响

根据拟合模型绘制乳白香青绿原酸的响应面图，可直观地看出响应面的最高点，即参数范围内的极值以及因素间的相互作用对响应值的影响，依次可以确定最佳工艺参数范围。Design-Expert 8.05软件处理后三维响应面图见图6。

通过模型方程所作的响应曲面图，可直观地描述各因素对响应值（绿原酸含量）的影响和各个因素间的交互作用。由图6可以看出，响应曲面均是开口向下的凸面，等高线近似为圆形，其中心位于所考察区域内，说明在考察的区域范围内存在响应值的极大值，同时响应面为突出的曲面，即简单的一次线性方程难以解析。

通过Design-Expert 8.05软件分析各因素对乳白香青中绿原酸得率的影响得出结论，甲醇提取乳白香青绿原酸的最佳条件为提取温度41.33℃、甲醇浓度66.33%和液料比31.33∶1。在此条件下绿原酸提取量可达5.3295mg/g。为检验响应面法的可靠性，采用上述最优提取条件进行乳白香青中绿原酸甲醇提取实验，同时考虑到实际操作的情况，将乳白香青绿原酸最佳提取条件修正为提取温度41℃、甲醇浓度66%、液料比31∶1，实际测得的绿原酸含量为5.2796mg/g，与理论预测值基本吻合。因此，采用响应面法优化得到的乳白香青中绿原酸甲醇提取工艺参数基本准确可靠，具有一定的实用价值。

3 结论与讨论

乳白香青成分复杂，采用紫外分光光度法测定[18]时杂质干扰严重，无法对其活性成分绿原酸进行定量分析。本实验参考文献[19]采用HPLC法并进行优化，以乙睛-0.3%磷酸溶液（13∶87）为流动相，分离度好、重现性好、操作简便、数据可靠，可用于乳白香青中绿原酸含量的质量控制。

本文在单因素实验的基础上，采用响应面法对乳白香青绿原酸提取工艺进行了优化，结果表明，各因素指标之间的关系不是简单的线性关系，而是二次关系。从本次实验数据所绘制的曲面图可以看出，提取温度、液料比、甲醇浓度3个因素对乳白香青中绿原酸成分提取率的效应趋势，液料比对考察指标影响较大，提取温度与提取浓度对考察指标的影响较小。通过回归方程优化得乳白香青中绿原酸的最佳提取工艺为：提取温度41℃，料液比31∶1，甲醇浓度为66%，此条件下乳白香青中绿原酸平均提取得率为5.2796mg/g，高于优化前的提取率3.8356mg/g。响应面法优化乳白香青中绿原酸提取率比优化前提高了27.40%。回归分析和验证实验结果表明，采用响应面法优化乳白香青中绿原酸的提取工艺条件，得到的绿原酸提取工艺流程具有实际应用价值。

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