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二次回归正交旋转组合优化罗非鱼下脚料酶解液螯合锌的工艺条件

2013-04-06李同刚洪鹏志

食品工业科技 2013年2期
关键词:下脚料食品科技螯合物

李同刚,洪鹏志,杨 萍,赵 阳

(广东海洋大学食品科技学院,广东湛江524088)

罗非鱼是当前淡水养殖业的重要养殖品种之一。我国是世界上最大的罗非鱼养殖国及出口国,2009年产量已达120万t,约占当年世界总产量的一半。罗非鱼冻鱼片加工过程中会产生总质量40%以上的下脚料[1-3]。罗非鱼下脚料蛋白酶解液含有丰富的氨基酸、小肽、微量元素等多种小分子营养成分,具有生物利用率高等优点。锌是人体必需微量元素,参与体内200多种酶的组成,是细胞内最丰富的微量元素。根据报道,锌是中国人缺乏的营养素之一,尤其是儿童、青少年缺锌比较严重,严重的已经影响智力和身高的正常发育。目前关于酶解物螯合金属元素的研究很多,如赵洪雷等[4]制备了低质鱼小肽螯合锌;杨珊珊等[5]研究了罗非鱼皮多肽制备锌螯合盐;钟明杰[6]用带鱼下脚料蛋白水解原料得到了钙、铁螯合物;汪学荣[7]使用猪血多肽制备铁螯合盐等。本实验利用复合酶酶解罗非鱼下脚料,对酶解液与锌的螯合工艺进行优化,探讨螯合的最佳工艺条件,旨在为罗非鱼下脚料的综合加工利用提供新途径,并希望为人体补锌提供安全、绿色原料。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

罗非鱼下脚料 由广东恒兴水产公司提供,罗非鱼下脚料(包括头、鱼骨排、内脏)去内脏,洗净,于绞肉机中绞碎后-18℃冻藏备用;中性蛋白酶(2.0×105U/g)、风味蛋白酶(1.5×104U/g)均购于南宁庞博生物工程有限公司;EDTA、硫酸锌 均为分析纯,购于广州化学试剂厂;二甲基橙 分析纯,广东光华化学厂有限公司。

PHS-3C酸度计 上海精密科学仪器有限公司;Mini pellicon超滤机 美国Thermo公司;DK-98-1电热恒温水浴锅 天津市泰斯特仪器有限公司;CR22GⅡ高速冷冻离心机 日本日立公司;EMS-4B磁力搅拌器 天津市欧诺仪器仪表有限公司;N-1100旋转蒸发仪 上海爱朗仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 酶解液的制备 取罗非鱼下脚料一定量置于烧杯中,按固液比1∶4加水,于55℃的恒温水浴锅中预热,按总加酶量1500U/g、中性蛋白酶与风味蛋白酶复合比1∶2加酶,pH不调,酶解30min。然后沸水灭酶15min,4500r/min离心15min得到上清液。将上清液通过0.45μm膜微滤,再过10ku超滤膜得到小于10ku的酶解液。

1.2.2 α-氨基态氮的测定 甲醛滴定法[8]。

1.2.3 螯合工艺

1.2.3.1 配位比对螯合率的影响 酶解液与硫酸锌在配位比(α-氨基态氮与锌离子的摩尔比[9])设为1.0∶1、1.5∶1、2.0∶1、2.5∶1、3.0∶1。

1.2.3.2 温度对螯合率的影响 螯合温度设为40、50、60、70、80℃。

1.2.3.3 时间对螯合率的影响 时间设为10、15、20、25、30min。

1.2.3.4 pH对螯合率的影响 螯合pH设为5、6、7、8、9。

在单因素实验基础上,进行二次回归正交旋转组合设计。螯合工艺流程:酶解液→测α-氨基态氮→按比例加Zn2+→搅拌→振荡合成→离心分离→真空浓缩→乙醇洗涤→测螯合率。

1.2.4 螯合率的测定 EDTA络合滴定法[10]。

式中:C-EDTA标准溶液的浓度,mol/L;V1-滴定螯合态微量元素所消耗的EDTA溶液体积,mL;V0-滴定微量元素的总量所消耗的EDTA溶液体积,mL。

1.2.5 二次回归正交旋转组合设计 依据单因素实验的结果,确定因素编码水平范围,采用二次回归正交旋转组合设计,以螯合率为指标,取配位比、温度、时间、pH作为考察因素,共进行31次实验,因素编码见表1。

1.2.6 实验结果处理 本实验均做了三次平行,结果为三次实验的平均值。

2 结果与分析

2.1 酶解液与硫酸锌螯合的单因素实验

2.1.1 配位比对螯合率的影响 配位比是影响螯合率的一个重要因素,因为配位比过小不能形成稳定的环状结构[5],导致螯合率较低;反之过大,螯合物虽稳定但是螯合率也在下降,造成原料的浪费,经济上也不合理。由图1可知,在温度60℃,时间15min,pH6.5时,配位比对螯合率的影响呈波动变化,配位比在2.5∶1时螯合率达到最大值。

2.1.2 温度对螯合率的影响 由图2可知,在配位比2.5∶1,时间15min,pH6.5条件下,随着温度的升高螯合率也升高,当温度在60~70℃时螯合率最高,再升高温度螯合率下降。这是由于螯合反应为吸热反应[11],温度高有利于螯合反应,但温度过高酶解液里的肽及其螯合物的结构易被破坏;温度过低,反应速率慢,螯合率不高。

2.1.3 时间对螯合率的影响 由图3可知,在配位比2.5∶1,温度60℃,pH6.5条件下,时间在15min时螯合效果最佳,10min时螯合反应不完全,所以螯合率不高;15min之后随着超滤酶解液中肽或氨基酸浓度的降低,螯合率也在下降。

2.1.4 pH对螯合率的影响 由图4可知,在配位比2.5∶1,温度60℃,时间15min条件下,pH对螯合率影响很大,随着pH升高螯合率先升后降,pH=7时效果最佳,当pH在5、6时螯合率缓慢上升,当pH>7以后螯合率下降很快。原因可能是当溶液中H+大量存在时,H+会与锌离子争夺供电子基团,不利于螯合物的生成;另外,在碱性条件下,羟基争夺锌离子而优先生成氢氧化锌沉淀而影响螯合物的形成[12]。

2.2 二次回归正交旋转组合优化酶解液与硫酸锌的最佳螯合条件

2.2.1 经验数学模型 在单因素实验的基础上,根据表1因素水平编码表进行二次回归正交旋转组合实验,实验设计及结果见表2。

将实验结果经Design Expert软件处理,得到回归方程:Y=87.59286+1.09375X1+0.72125X2+0.47375X3-0.87625X4+0.30437X1X3+1.06938X2X3+1.30563X2X4-1.39228-2.17853-1.81603-1.717282。

2.2.2 二次回归模型的显著性检验 二次正交旋转组合设计实验结果方差分析如表3所示。

为检验回归方程的有效性,按F1=失拟均方/误差均方,F2=回归均方/剩余均方的程序进行检验。由表3可知,在0.01水平上失拟项F1不显著、F2极显著,这表明方程与实验数据的配合是可行的,可以用来建立模型。

根据表3,剔除α=0.10显著水平不显著项后,简化后的回归方程为:Y=87.59286+1.09375X1+0.72125X2+0.47375X3-0.87625X4+1.06938X2X3+1.30563X2X4-1.39228-2.17853-1.81603-1.71728。

该模型的R2=0.95588,R2adj=0.91727,说明回归方程对实际实验拟合情况较好。

2.2.3 模型验证 为验证模型的适用性,选取4组结果进行验证。结果见表4。

由表4可知,4组的螯合率测定结果与根据模型计算得到的结果误差均小于5%,说明该模型能较好地反映螯合过程螯合率的变化情况。

2.2.4 各因素的重要性分析 在表3里,因为X1、X2、X3、X4的均方分别为28.71094、12.48484、5.38654、18.42754,所以影响螯合率的四因素主次顺序为:配位比>pH>温度>时间。

2.2.5 最佳螯合条件的确定 采用Design Expert软件分析实验数据,得到螯合的最佳条件为:配位比0.39水平(2.70∶1),温度0.25水平(71.25℃),时间0.22水平(15.44min),pH为-0.29水平(6.86),理想螯合率可达88.08%。考虑到实验室允许的条件以及实际应用过程中的必要性和可操作性,对优化的工艺参数进行了合理选择,即配位比2.70∶1、温度71.3℃、时间15min、pH6.86,验证实验结果表明,此时螯合率可达87.56%,与理论值相差1%之内。在相关研究中,低质鱼蛋白多肽在理想条件下与铁的螯合率为94.15%[5];带鱼下脚料蛋白水解液在最佳条件下与钙螯合,螯合率达79.75%[6],大部分植物蛋白螯合率不高。相比之下,本实验得到的螯合条件较合理。

3 结论

本实验在单因素实验结果的基础上,运用二次回归正交旋转组合设计的方法,确定了罗非鱼下脚料酶解液螯合锌的最佳螯合工艺条件为:配位比2.70∶1、温度71.3℃、时间15min、pH6.86,螯合率达到87.56%,其中,各个因素对螯合率影响大小的顺序是:配位比>pH>温度>时间。

[1]杨萍.罗非鱼下脚料蛋白酶解液制备蔬菜泥罐头的研究[J].食品科技,2008(5):89-91.

[2]赵梅.罗非鱼下脚料酶解工艺的响应面法优化[J].食品研究与开发,2007(5):48-52.

[3]吴燕燕,李来好.酶法由罗非鱼加工废弃物制取调味料的研究[J].南方水产,2006,2(1):49-53.

[4]赵洪雷,李春美.低质鱼小肽螯合锌制备工艺的研究[J].食品科技,2009(1):18-19.

[5]杨珊珊.罗非鱼皮多肽锌螯合盐的制备及性质研究[D].南昌:南昌大学,2008.

[6]钟明杰.带鱼下脚料蛋白水解螯合物制备及生物特性研究[D].青岛:中国海洋大学,2009.

[7]汪学荣.猪血多肽铁螯合盐的制备技术及性质研究[D].重庆:西南大学,2008.

[8]陈义勇,王伟,沈宗根.罗非鱼下脚料水解工艺的研究[J].现代食品科技,2006,22(4):136-138,126.

[9]霍健聪,邓尚贵,谢超.带鱼下脚料蛋白多肽亚铁鳌合物的制备及抗氧化活性研究[J].食品工业科技,2009(4):267-270.

[10]吴茹怡,曾里,曾凡骏.复合氨基酸螯合物鉴定方法的研究[J].食品科技,2006(3):104-112.

[11]陈亚房.大豆低聚肽制备及其ACE抑制活性和螯合特性的研究[D].北京:中国农业科学院,2009.

[12]STRICKLAND R D,FREEMAN M L,GURULE F T.Copper binding proteins in alkaline solution[J].Analytical Chemistry,1961,33(4):545-552.

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