刘军，张朋书，于晴，邱海波

(东南大学附属中大医院 ICU，江苏南京 210009)

小鼠由于来源广泛、免疫及遗传背景清楚、基因与人类相似、价格便宜、所需试剂的量相对较小，是急性肺损伤(ALI)、肺部感染、哮喘、肺气肿、肺纤维化等肺部疾病动物模型中常用的动物［1］。制备小鼠肺单细胞悬液为近年一些实验室常用的技术，是肺细胞生物学研究的前提。实体肺组织单细胞悬液的制备较为困难，获得产率高、活性高、功能强的单细胞对于进一步的实验研究十分必要，而细胞数量不足、细胞碎片过多、细胞粘连成团等均可导致整个实验的失败［2］。近年来，尽管小鼠作为模式动物在生物医学研究中的优势越来越明显，但目前有关肺单细胞悬液制备的报道较少，尤其是动物实验中小鼠肺组织量极少(成年小鼠肺组织仅约100～150 mg)，如何应用少量小鼠肺组织制备足量的肺单细胞悬液以进一步进行实验研究值得关注。

目前常见的分散组织以制备单细胞悬液的方法有机械法和化学(酶消化)法［3］。现在分离组织单细胞悬液常用的有以下方法:机械法，适宜于一些纤维成分很少的软组织，但该方法对组织损伤较大，易引起细胞损伤和丢失;酶消化法，适宜于含结缔组织成分多的标本，所需的组织需要量少，但酶可消化细胞膜上的某些成分［3］。机械分离法简单，但由于分离组织不彻底、含有组织块较多、分离的细胞数量偏少等原因，现已较少采用，宜根据组织类型、研究目的及要求选择恰当的方法和试剂。制备小鼠肺单细胞悬液是非常重要的一个实验环节，对于研究肺部疾病的细胞学机制，探讨防治策略具有重要意义。本实验应用少量的小鼠肺组织，采用胶原酶Ⅴ酶消化法成功制备了小鼠肺单细胞悬液，并应用细胞计数和流式细胞术等对其进行了鉴定。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SPF级健康雄性C57BL/6小鼠，6～8周龄，体质量18～22 g，购自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供［合格证号:苏SCXK(军)2007-004］。

1.1.2 主要试剂及配制 Ⅴ型胶原酶和台盼蓝均购自Sigma公司，Hank's平衡液、PBS液和红细胞裂解液由碧云天生物技术研究所提供，牛血清白蛋白购自Roche公司。

应用Hank's平衡液以175 U·ml-1浓度配制胶原酶Ⅴ消化液，牛血清白蛋白使用时以新鲜配制的PBS液配制为1%浓度。

1.2 实验方法

1.2.1 小鼠肺的采集 小鼠处死，75%医用乙醇消毒局部皮肤，无菌操作打开胸腔取出肺脏并移入平皿中，无菌PBS清洗肺组织表面的血液及血凝块，去除气管和支气管。

1.2.2 胶原酶Ⅴ消化法制备肺单细胞悬液 取30 mg肺组织，无菌状态下应用眼科剪将肺组织轻柔剪成1～2 mm3小块，然后用匀浆机匀浆1 min。将组织加入预热至37℃的新鲜胶原酶Ⅴ消化液中，置入37℃的水浴箱中，每隔3～5 min轻轻振摇1次。60 min时可见肺组织几乎全部消化，冰浴终止消化，轻轻吹打分散细胞，收集消化液;200目不锈钢网过滤;离心(1 000 r·min-1，5 min);去上清，加入PBS轻柔吹打;离心去上清;加入红细胞裂解液5 ml，冰上孵育10 min;离心去上清;加入PBS吹打，再离心漂洗1～2次，去上清，加入含1%BSA的4℃ PBS2 ml得到小鼠肺单细胞悬液。

1.3 细胞鉴定

1.3.1 细胞形态学观察 光学显微镜下观察肺细胞形态。

1.3.2 细胞计数 吸取少量细胞悬液，加到细胞计数板上，在倒置显微镜(10×物镜)下计数4个大方格内的细胞总数。按公式计算，细胞数目=(4大格细胞数之和/4)×104×细胞原液量(ml)。

1.3.3 细胞活性测定(台盼蓝排斥实验) 吸取9滴细胞悬液，加入1滴0.4%台盼蓝，混匀后在3 min内计数活细胞和死细胞数量，计数细胞活性率。蓝染细胞为死亡细胞，活细胞不着色。计数200个细胞，计算出活细胞百分率。

1.3.4 流式细胞术检测肺细胞悬液 取小鼠肺单细胞悬液样本，离心去上清，加入0.5 ml PBS溶液，混匀后应用流式细胞仪检测分析。

2 结 果

2.1 细胞形态

光镜下，胶原酶Ⅴ消化法所得小鼠肺细胞多种多样、大小不一，但细胞形态完整、边界清晰、分散度好、背景较干净、杂质及细胞碎片较少、细胞团较少(图1)。

图1 分离的小鼠肺细胞图 ×100Fig 1 Morphology of isolated lung cells in mice ×100

2.2 细胞计数及细胞活性率

胶原酶Ⅴ消化肺细胞产量高、活力好，通常30 mg小鼠肺组织可提取有核细胞数量为(1～4)×106个。肺单细胞悬液中活细胞百分率均在95%以上(图2)。

图2 小鼠肺单细胞悬液台盼蓝染色图 ×400 Note:arrows indicate necrotic cells stained with blueFig 2 Trypan blue staining of lung single cell suspension in mice ×400

2.3 流式细胞术检测肺单细胞悬液

流式细胞术检测小鼠肺单细胞悬液见大量的肺细胞(图3)。

3 讨 论

呼吸系统疾病发病率高，在该领域内的实验性研究已从实验动物的大体水平渐转移到单细胞乃至分子水平［4-5］，要从结果复杂的肺组织检测某种细胞必须对肺组织进行分离，制备肺单细胞悬液是进行细胞体外培养和细胞生物学研究的首要环节，这就需要一种简单、稳定、高效的肺实质细胞的分离方法，以为科研工作提供高效的平台。

图3 小鼠肺单细胞悬液流式细胞图Fig 3 The representative dot plot showing mice lung single cell suspension

目前分离组织单细胞悬液常用的有以下方法:机械分离法，适宜于一些纤维成分很少的软组织，但该方法对组织损伤较大，易引起细胞损伤和丢失;酶消化法适宜于含结缔组织成分多的标本，所需的组织需要量少，但酶可消化细胞膜上的某些成分［3］。机械分离法简单，但由于分离组织不彻底、含有组织块较多、分离的细胞数量偏少等原因现已较少采用。

由于小鼠本身肺组织量少，含结缔组织较多，本研究采用酶消化法直接制备肺单细胞悬液。胶原酶仅对细胞间质有消化作用而对实质细胞影响不大，且其消化作用不受一些离子和血清等成分的影响，故本实验应用胶原酶Ⅴ进行酶消化［3，6］。

本研究结果显示，应用胶原酶Ⅴ酶消化法制备肺单细胞悬液，光镜下见细胞大小不一、形态多样，提示是多种细胞的混合物，可能包括各型上皮细胞、内皮细胞、白细胞、成纤维细胞等。另外，少量肺组织(30 mg)可以获得(1～4)×106个肺细胞，提示本方法分离少量肺组织获得的单细胞数量足以满足一般肺细胞生物学研究的需要，便于施加处理因素，并有利于进行流式细胞术、细胞培养等实验。

流式细胞术应用于肺组织细胞研究，具有快速、准确、高灵敏、多参数检测细胞等特点，用流式细胞术对肺组织单细胞各种免疫表型分析都必须基于单细胞基础之上，肺单细胞悬液样品制备是其分析的关键［2，7］。我们采用流式细胞术鉴定分离的肺细胞，发现肺细胞悬液中有大量的单细胞(图3)，也证实胶原酶Ⅴ酶消化制备肺单细胞悬液方法高效可靠。被分散的肺组织细胞是多种细胞的混合物，可通过分析荧光标记的特异性抗体表达，进一步检测某个或某些特定的细胞群。

实体组织单细胞悬液制备比较困难，需注意的事项较多。本实验中，我们发现以下因素与实验成功率和分离的细胞数量密切相关:(1)掌握无菌原则。包括取肺、配制试剂等应注意无菌原则，避免滋生一些不必要的细菌，影响到最后的检测结果。(2)操作动作轻柔。避免损伤组织细胞，尽量减少细胞碎片。(3)不锈钢网孔径。不锈钢网孔径影响过滤细胞的大小，过大则可能液体中含大量的细胞团块，孔径过小会引起大量细胞丢失。(4)离心速度和时间。离心速度过快、时间过长，造成细胞损伤，甚至死亡，同时会挤压细胞，细胞凝集重新变成团块状，不利于均匀分散悬浮，且还会使得在最后的检测中发现大量残余的细胞碎片，影响结果;离心速度太慢或时间过短，组织细胞容易悬浮，既不能有效去除碎片，更造成不必要的细胞损失;因此，在离心时要注意离心的速度和时间。(5)胶原酶Ⅴ消化液工作温度。在胶原酶Ⅴ作用期间要注意保持37℃消化。(6)酶消化液作用时间。时间会影响酶消化效果，本实验发现，30 mg的肺组织胶原酶Ⅴ在37℃消化1 h，可以取得满意结果。(7)酶消化液量。一般要求酶消化液容积为肺组织体积30～50倍，本研究在进行酶消化时，一般30 mg的肺组织给予4 ml的胶原酶Ⅴ酶消化液(175 U·ml-1)可取得较好效果。(8)振摇。酶消化时每隔数分钟轻轻振摇数次以增加酶作用面积，如能放置在37℃的恒温震荡水浴箱中更好，如组织块经振摇后成细胞团或单个细胞，即可认为已消化充分。(9)酶消化液最好临用时配制，新鲜酶消化液效率高。(10)细胞在保存液中的状态。不同的细胞其保存液的浓度不同，这就要求调试到最适合浓度以使得细胞在液体中能保持单个的均匀分散的状态。

总之，应用胶原酶Ⅴ酶消化法制备肺单细胞悬液简单、高效、稳定，无需进行肺细胞培养却可以直接得到大量单细胞，非常适合于肺细胞病理、生理变化的研究。

［1］MATUTE-BELLO G，FREVERT C W，MARTIN T R.Animal models of acute lung injury［J］.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2008，295(3):L379-399.

［2］DEMEDTSI K，BRUSSELLE G G，VERMAELEN K Y，et al.Identification and characterization of human pulmonary dendritic cells［J］.Am J Respir Cell Mol Biol，2005，32(3):177-184.

［3］司徒镇强，吴军正.细胞培养［M］.西安:世界图书出版西安公司，2007:53-57.

［4］唐晓媛，于化鹏，邓火金，等.不同剂量致敏原对小鼠哮喘模型中气道反应性的变化［J］.现代医学，2011，39(2):121-125.

［5］顾小军.实验性糖尿病酮症酸中毒家兔Ⅰ型肺泡上皮细胞损伤和修复状况研究［J］.现代医学，2011，39(4):393-397.

［6］MARTIN J，DINSDALE D，WHITE I N.Characterization of clara and typeⅡcells isolated from rat lung by fluorescenceactivated flow cytometry［J］.Biochem J，1993，295(1):73-80.

［7］VERMAELEN K，PAUWELSR.Accurate and simple discrimination of mouse pulmonary dendritic cell and macrophage populations by flow cytometry:methodology and new insights［J］.Cytometry A，2004，61(2):170-177.