戴建国，王中立，陈琳，赵玉男，詹，黄玉芳

(南京中医药大学中西医结合学科，江苏南京 210046)

助阳宁神方基于中医临床“助阳入脑，降火宁神”抑郁症治疗思想，由南京中医药大学王旭东教授提出，该方由制附子、淫羊藿、酸枣仁和知母4味中药组成，前两者用于“助阳”，后两者用于“宁神”，分别作用于阴阳两端，调节抑郁症患者阴阳平衡紊乱。该方经国内外临床应用，疗效显著。前期动物实验发现:该方在强迫游泳和强迫悬尾实验中表现出明显抗抑郁作用，但该方作用机制尚未明了，为此，本实验拟对其可能机制展开初步研究。采用5-羟色氨酸(5-HTP)诱导的甩头模型、育亨宾毒性模型检测行为学改变，皮质酮皮下注射制备应激抑郁动物模型，免疫组化及Western blot检测给药前和给药4周后小鼠海马星形胶质细胞胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达改变，期望初步明确其治疗机制，并能为该方的临床应用提供理论实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 成年健康雄性C57BL/6N小鼠，体重18～22 g，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号 SCXK(沪)2007-0005。饲养于南京中医药大学动物实验中心恒温恒湿动物房，明暗交替时间为12 h，动物可以自由饮食进水。

1.1.2 药物、试剂 皮质酮购自Sigma公司，批号079K1594;氟西汀由苏州制药有限公司生产，批号8146B。5-HTP、帕吉林和育亨宾均购自Sigma公司。其他试剂均为分析纯，购自南京化学试剂公司。

1.2 方法

1.2.1 动物模型的制备 皮质酮皮下反复注射复制抑郁小鼠模型参考Zhao等［1］的研究。首先将皮质酮溶于二甲基亚砜(DMSO)中作为储液，根据所用药水煎剂灌胃给予动物，给药剂量由人临床常规用量换算成小鼠用量，设置助阳宁神方高(7.6 g·kg-1)、中(3.8 g·kg-1)、低剂量(1.9 g·kg-1)组。阳性药物氟西汀根据临床使用剂量，换算成小鼠用量为3.6 mg·kg-1。注射用帕吉林液由灭菌去离子水配成10 mg·ml-1液体，现配现用。注射用5-HTP由生理盐水配成浓度为1 mg·ml-1液体，置于-20℃冰箱备用。

1.2.2 生药水煎剂的制备及给药剂量 生药在砂锅中浸泡30 min，武火煮沸后文火煎煮20～30 min，滤出药汁，反复3次，混合药汁，浓缩即得，生药质量浓度计为 g·ml-1。

1.2.3 分组 根据小鼠体重随机分为6组(每组8只)，即模型组，正常组，氟西汀组，助阳宁神方高、中、低剂量组。除正常组外其他各组均给予造模处理。给药与造模同时进行，正常组和模型组给予蒸馏水，其他各组给予相应剂量助阳宁神方。实验共进行4周，第4周后处死小鼠，行免疫组化及Western blot检测。

1.2.4 免疫组化染色 实验完成后给予10%水合氯醛腹腔注射麻醉，打开胸腔，左心室插管，剪开右心耳，用预温的37℃生理盐水约20 ml快速冲洗，再以预冷的10%多聚甲醛灌注固定30 min后断头取脑，放入盛有相同10%多聚甲醛的瓶中固定24 h，利用小鼠脑模具将各组小鼠脑组织切割成等大的包含海马区域的脑片，浸泡于30%蔗糖水中，待脑片沉入液体底部，取出应用冰冻切片包埋剂包埋，冰冻切片。漂染法进行两步法免疫组织化学染色，具体操作流程如下:(1)滴加正常羊血清封闭，室温30 min。(2)3%过氧化氢灭活内源性过氧化物酶，室温15 min。(3)兔抗GFAP(1∶1 000)，4℃过夜。(4)聚合物羊抗兔IgG，37℃1 h。(5)使用DAB显色试剂盒显色，镜下控制反应时间。在步骤(3)、(4)、(5)后均用0.01 mol·L-1PBS 漂洗3次，每次5 min。阴性对照试验:省去一抗，用正常羊血清代替一抗。每组选取5张切片，每张3个视野，使用图像分析系统Imagepro-Plus统计每个视野中阳性细胞面积及总光密度值。

1.2.5 Western blot检测 双侧海马组织用1 ml的RIPA 缓冲液［50 mmol·L-1Tris-HCl、0.1%SDS、1%NP-40、1 mmol·L-1EDTA、150 mmol· L-1NaCl、1 mmol·L-1苯甲基磺酰氟(PMSF)、1 mg·L-1抑肽酶、1 mg·L-1亮抑肽酶，去离子水配置，pH 7.5］匀浆，12 000 r·min-1离心后取上清液。对所得上清液进行蛋白定量以确定电泳时样品的上样量，然后按比例加入上样缓冲液［1%SDS、1% 二硫苏糖醇(DTT)、10 mmol· L-1Tris-HCl、10% 甘 油、1 mmol· L-1EDTA、0.2%溴酚蓝，去离子水配置，pH 8.0］，混合后在95℃水浴中变性5 min。变性的样品液经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后，湿法将胶上的蛋白转移到PVDF膜上。转膜成功后，用PBST(含0.05% 吐温-20的PBS液)稍加漂洗后放入封闭液(含5%脱脂奶粉的PBST液)中，37℃振荡1 h。封闭结束后，一抗室温轻摇孵育2 h或4℃静置过夜。PBST漂洗3次(每次5 min)后，二抗室温孵育1 h。PBST再次漂洗3次，采用化学发光法，暗室曝光显影胶片。最后，将胶片上目的条带扫描进电脑，用Bandscan软件进行灰度分析。

1.2.6 5-HTP诱导的甩头行为模型 实验分为正常组，氟西汀组，助阳宁神方高、中、低剂量组(剂量同上)，共5组，每组10只ICR小鼠。按100 mg·kg-1的剂量皮下注射帕吉林液(10 ml·kg-1)，90 min后按10 mg·kg-1的剂量腹腔注射5-HTP，在连续给药7 d后第15 min分别记录各组小鼠甩头行为次数。

1.2.7 育亨宾毒性模型 动物分组、动物数与给药同“1.2.6”。按2.5 mg·kg-1的剂量腹腔注射育亨宾(10 ml·kg-1)，注射1 h后观察各组死亡小鼠只数。

1.2.8 数据处理 用SPSS 16.0统计软件包对实验数据进行统计学处理，计量资料用±s)表示，多组比较采用单因素方差分析;计数资料采用卡方检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 海马GFAP表达结果

2.1.1 Western blot检测GFAP表达结果 与正常组相比，模型组小鼠海马组织内GFAP表达明显下降(P＜0.01);与模型组比，氟西汀组和助阳宁神方高、中、低剂量组均能上调GFAP表达(均P＜0.05)。见图1。

图1 GFAP的Western blot检测结果Fig 1 The results of GFAP by Western blot

2.1.2 GFAP免疫组化表达结果 在海马CA3区和CA1区，与正常组比，模型组GFAP阳性区域总光密度值和面积均明显下调(P＜0.05或P＜0.01)，与模型组比，助阳宁神方高、中、低剂量组均能显著上调GFAP阳性区域总光密度值(P＜0.05或P＜0.01);在CA3区助阳宁神方高、中剂量组及在CA1区助阳宁神方中剂量组GFAP阳性表达区域面积明显上调(P＜0.05或P＜0.01);在DG区，各组GFAP阳性表达区域面积均无明显上调(P＞0.05)，但GFAP阳性表达区域总光密度值明显上调(P＜0.05或P＜0.01)。见图2、3。

图2 海马阳性区域面积结果Fig 2 The positive results of hippocampus area

图3 海马阳性区域总光密度值结果Fig 3 Hippocampal positive regional total optical density value result

2.2 5-HTP诱导的甩头模型结果

盐酸氟西汀可高选择性抑制突触前膜对5-羟色胺(5-HT)的再摄取，提高中枢浓度，能明显增加5-HTP诱导的小鼠甩头行为次数，因此，与正常组(67±18.92)比，氟西汀组小鼠甩头行为次数显著增加(416.5±125.96，P＜0.01);而助阳宁神方高、中、低剂量组小鼠甩头次数均未明显增加(61.4±14.28，48.25±11.96，57.6±10.74，均P＞0.05)。见图4。

图4 给药后不同组5-HTP诱导的甩头次数(n=10)Fig 4 The results of head-twitching behavior in different groups after administration

2.3 育亨宾毒性模型实验结果

育亨宾毒性模型中，与正常组小鼠死亡1只相比，氟西汀组死亡5只，小鼠死亡率显著增加(P＜0.05)，而助阳宁神方高、中、低剂量组死亡小鼠数依次是2、1、1只，与正常组比，小鼠死亡率无显著性增加(均P＞0.05)。

3 讨 论

抑郁症是一种以心境低落为主要特征的情感性精神障碍，其发病率逐年升高。据WHO报道，目前抑郁症已成为世界第四大疾患，到2020年可能成为仅次于缺血性心脏病的第二大疾病，因此，其防治研究备受关注。临床常用的抗抑郁药多为基于抑郁症发病机制的单胺类神经递质假说，即通过调节突触间隙单胺类神经递质来发挥疗效。张杰等［2］研究了医院销售金额、用药频度等数据，发现抗抑郁药中选择性5-HT再摄取抑制剂应用占主导地位。然而该类药物对部分患者疗效欠佳，因此，探索新的有效治疗药物和方法逐渐成为研究热点。如张晓斌等［3］就应激以及氟西汀对抑郁模型大鼠海马区GDNFmRNA表达影响进行探讨，期望通过对抑郁症与星型胶质细胞的关系研究可进一步理解抑郁症的病理生理机制以及新型抗抑郁药物的作用机理。

在5-HTP诱导的甩头行为模型中发现，与正常组比，助阳宁神方高、中、低剂量组小鼠甩头次数无明显增多(P＞0.05)，而氟西汀组(5-HT再摄取抑制剂)却可通过高选择性抑制突触前膜对5-HT的再摄取提高中枢浓度，能明显上调5-HTP诱导小鼠的甩头行为次数;育亨宾毒性模型实验结果显示，助阳宁神方高、中、低剂量组小鼠死亡只数未见明显增加(P＞0.05)，因此推测，该方抗抑郁作用可能不是通过影响单胺类神经递质而产生，其机制值得进一步研究。

本实验抑郁动物模型采用 Zhao等［1，4］的方法，该模型稳定，方法简单，制备容易，重复性好，目前已被国内外大量使用于抗抑郁药物的筛选，为此，本实验采用该模型。陈红霞等［5］认为海马神经元和星形胶质细胞共同参与了抑郁症发生，胍丁胺和氟西汀可逆转慢性应激引起的细胞形态结构改变，发挥抗抑郁作用。Banasr等［6］认为仅星形胶质细胞丢失就足以引起抑郁症产生。说明星形胶质细胞在抑郁症产生中起重要作用。GFAP作为星形胶质细胞特性骨架蛋白，为星形胶质细胞独有，其表达高低反映了星形胶质细胞的活性。本组实验发现在皮质酮应激模型上，模型组GFAP表达下调，说明星形胶质细胞活性下降，而助阳宁神方高、中、低剂量组均能上调GFAP表达。免疫组化结果显示，模型组GFAP阳性表达总光密度值明显下调，助阳宁神方各组均能上调海马CA1、CA3、DG区GFAP阳性表达总光密度值;CA1、CA3区GFAP阳性表达区域面积也上调，说明助阳宁神方水煎剂能上调星形胶质细胞活性。因此，助阳宁神方可能通过上调星形胶质细胞的活性而发挥抗抑郁作用。

综上所述，助阳宁神方拮抗小鼠抑郁样作用可能不是通过影响单胺类神经递质产生，而是可能与调节星形胶质细胞的活性有关，但其确切机制尚有待进一步研究。

［1］ZHAO Y，MA R，SHEN J，et al.A mouse model of depression induced by repeated corticosterone injections［J］.Euro J Pharm，2008，581(1-2):113-122.

［2］张杰，唐亮.2005-2007年我院抗抑郁药应用分析［J］.现代医学，2009，37(2):162-163.

［3］张晓斌，张志珺，谢春明，等.氟西汀对抑郁模型大鼠海马区胶质细胞源性神经营养因子mRNA表达的影响［J］.东南大学学报:医学版，2009，28(3):228-232.

［4］ZHAO Y N，XIE W D，DAI J G，et al.The varying effects of short-temand long-term corticosterone injections on depressionlike behavior in mice［J］.Brain Res，2009，1261:82-90.

［5］陈红霞，张黎明，张有志，等.胍丁胺对慢性应激大鼠海马神经元和星形胶质细胞的影响［J］.中国药理学通报，2009，25(1):21-25.

［6］BANASR M，DUMAN R S.Glial loss in the prefrontal cortex is sufficient to induce depressive-like behaviors［J］.Biol Psychiatry，2008，64:863-870.