陈猛，郝林，史振铎，张辉，董洋，韩从辉

(1.东南大学医学院，江苏南京 210009;2.东南大学医学院附属徐州医院泌尿外科，江苏徐州 221009)

基因治疗膀胱癌是现在的研究热点，腺病毒是常用的载体之一。而超抗原靶向抗肿瘤模式为肿瘤治疗提供了一个新的方向，并显示出良好的应用前景。我们根据端粒酶高表达于人恶性肿瘤和缺氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)在膀胱癌中表达上调的特点构建了携带超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素A(staphylococcal enterotoxins A，SEA)基因的人端粒酶逆转录酶(hTERT)/HIF双调控溶瘤腺病毒PPE3-SEA。体外实验证实，PPE3-SEA对人膀胱肿瘤EJ细胞具有杀伤作用［1］。然而免疫治疗使得动物实验无法使用裸鼠模型，因此hTERT启动子和HIF启动子能否在鼠肿瘤细胞中与相应的转录因子结合使SEA表达成为动物实验的关键。Shieh等［2］实验表明，在小鼠膀胱癌MBT-2中hTERT启动子具有明显活性并能使其下游的胞嘧啶脱氨酶基因表达。本实验旨在观察PPE3-SEA能否感染小鼠膀胱癌MB49并表达SEA基因。

1 材料和方法

1.1 材料

腺病毒PPE3-SEA由实验组构建并保存，小鼠膀胱癌细胞MB49由天津泌尿外科研究所提供，RT-PCR试剂盒购自南京凯基公司，逆转录-聚合酶链反应引物合成于南京金斯瑞公司，SEA单克隆抗体购自Santa Cruz公司。

1.2 生物倒置显微镜下观察细胞感染腺病毒后形态学变化

取对数生长期MB49细胞胰酶消化、离心，分别计数5×103接种到96孔板，待细胞贴壁后分别加入0、5、10、40 MOI腺病毒感染细胞，每组8个复孔。分别于12、24、48 h在OLYMPUS生物倒置显微镜下观察细胞生长状态并拍照。

1.3 RT-PCR检测PPE3-SEA在MB49细胞内SEA的mRNA表达

根据GenBank已知的SEA基因序列用Primer 5软件设计引物，上游引物:5'-TAGCGAGAAAAGCGAA-3'，下游引物:5'-ATCCAACTCCTGAACAG-3'。取对数生长期MB49细胞胰酶消化、离心，计数1×106个细胞加入10个培养瓶中，待细胞贴壁后分别加入0、5、10、40 MOI腺病毒感染细胞，分别于 12、24、48 h 提取细胞总RNA，测定RNA浓度和纯度后按试剂盒说明书逆转录成cDNA。以GAPDH为内参照进行PCR扩增，循环参数为95℃预变性5 min;95℃变性40 s，52℃退火30 s，72℃延伸35 s，进行32个循环;最后72℃延伸10 min。反应结束后取反应液5μl进行1%琼脂糖凝胶电泳，确认PCR反应产物。

1.4 Western blot检测SEA蛋白表达

取各组细胞于冷PBS洗涤后加入400μl冰预冷裂解缓冲液，混匀后冰浴30 min，每隔5 min涡旋振荡10 s，充分裂解后离心取上清分装。Bradford法蛋白定量后用裂解缓冲液稀释相同浓度，煮沸5 min后加样电泳，湿电转移，封闭;一抗1∶200稀释，摇床摇荡孵育;二抗1∶5 000稀释，室温下摇荡孵育2 h;加显影液后曝光，显影，洗像。

2 结 果

2.1 显微镜下观察细胞形态

未加腺病毒的细胞呈梭形;感染腺病毒的细胞呈圆形，细胞折光性增强，呈葡萄状排列。病变细胞随浓度的增加而增多，随着感染时间延长，细胞折光性进一步增强，最终裂解(图1)。

2.2 RT-PCR检测mRNA表达

用SEA引物分别对阴性对照组48 h及实验组各时段反转录产物进行PCR鉴定，结果显示SEA在实验组各时间段细胞中RNA水平成功表达，而阴性对照组未表达(图2)。

2.3 Western blot检测SEA蛋白表达

取阴性对照组48 h和实验组各时段细胞进行免疫印迹分析，结果显示:阴性对照组未检测到SEA蛋白表达，而实验组均检测到SEA蛋白(图3)。

3 讨 论

膀胱癌是我国泌尿系统最常见的恶性肿瘤，其临床分期、病理学分级与多种基因表达相关［3-5］。目前治疗膀胱癌的主要方法是以手术为主，术后辅以膀胱内灌注治疗，但复发率高，治疗效果远不能让人满意。陈波等［6］回顾性分析经尿道膀胱肿瘤电切术加二次经尿道膀胱肿瘤电切术治疗膀胱肿瘤，术后膀胱灌注吡柔比星，膀胱癌总复发率仍为18.37%，而开放行膀胱癌部分切除术组的总复发率高达33.5%。自Morales等［7］首先使用卡介苗(bacillus calmette-guerin，BCG)治疗膀胱癌以来，膀胱癌的免疫治疗得以迅速发展，但BCG膀胱灌注的并发症(膀胱炎、血尿、发热、肉芽肿、肺炎、脓毒症、关节炎、关节痛、输尿管梗阻和膀胱痉挛等)限制了其广泛应用。在免疫治疗过程中也可能会出现与免疫相关的疾病，因此膀胱癌的靶向免疫治疗成为新的研究方向和热点。hTERT启动子被广泛用于构建溶瘤腺病毒携带目的基因靶向治疗肿瘤。在hTERT和mTERT启动子的核心区有50%的相似性。Gu等［8］用 Ad/hTERT-LacZ感染小鼠纤维肉瘤细胞UV-2237m、Lewis肺癌细胞LLC、M109肺癌细胞、小鼠肺腺癌LM2细胞、小鼠成纤维细胞NIH3T3和正常鼠成纤维细胞NMFB检测hTERT启动子的活性，结果表明hTERT启动子能有效地使用小鼠转录机，在小鼠肿瘤细胞中具有高活性而在正常细胞中相对静止。我们实验中发现PPE3-SEA腺病毒可以感染小鼠膀胱癌细胞MB49，最终导致细胞裂解并于感染腺病毒组均检测到SEA的mRNA和蛋白的表达，再次证实hTERT启动子和HIF启动子能有效使用小鼠转录机。小鼠基因组测序计划已完成，人类99%的基因存在于小鼠，基因组同源性高达78.5%，93%的区域基因排列顺序与人类相同。龙跃生等［9］分析证明，人和小鼠SCN3A基因核心启动子的同源性高达96.0%。以上研究结果为以启动子作为靶向治疗方法的实验提供了新的参考方向和理论依据。

图1 显微镜下不同浓度腺病毒感染肿瘤细胞后的各时段细胞形态 ×200Fig 1 The cellular morphology of different time after infected by different concentration adenovirus under the microscope ×200

图2 不同浓度腺病毒组各时段反转录产物鉴定Fig 2 The identification of reverse transcription's production

图3 Western blot结果Fig 2 The results of Western blot

［1］胡建鹏，郝林，张培影，等.双调控溶瘤腺病毒介导超抗原SEA基因靶向膀胱癌肿瘤表达［J］.中华实验外科杂志，2010，27(8):1131-1133.

［2］SHIEH G S，SHIAU A L，YO Y T，et al.Low-dose etoposide enhances telomerase-dependent adenovirus-mediated cytosine deaminase therapy through augmentation of adenoviral infection and transgene expression in a syngeneic bladder tumor model［J］.Cancer Res，2006，66(20):9957-9966.

［3］杨立新，张海峰，白淑芬.P53、Ki-67基因表达与膀胱癌相关性的回顾性研究［J］.现代医学，2010，38(1):32-35.

［4］应文群，李巧星.hTERT和survivin在膀胱癌移行细胞癌中的表达及意义［J］.肿瘤基础与临床，2006，19(1):19-20.

［5］何汀，陈明，章宜芬，等.Mel-18在人膀胱尿路上皮肿瘤组织中的表达及意义［J］.现代医学，2010，38(3):212-216.

［6］陈波，贺厚光，韩从辉，等.二次经尿道膀胱肿瘤电切治疗非浸润性膀胱肿瘤［J］.东南大学学报:医学版，2010，29(6):665-667.

［7］MORALESA，EIDENGER D，WARD A W.Intracavity Bacillus Calmette-Guerin in the treatment of superficial bladder tumours［J］.JUrol，1976，116(2):180-183.

［8］GU J，ANDREEFF M，ROTH J A，et al.hTERT promoter induces tumor-specific Bax gene expression and cell killing in syngenic mouse tumor model and prevents systemic toxicity［J］.Gene Ther，2002，9(1):30-37.

［9］龙跃生，赵绮华，曾涛，等.人及小鼠钠通道SCN3A基因的启动子及其上游调控区的分析［J］.生物化学与生物物理进展，2009，36(3):339-345.