姚远，李艳，赵鸿梅

(辽宁省人民医院消化内一科，辽宁沈阳 110016)

胃癌是消化道常见的恶性肿瘤之一，在国内不少地区的恶性肿瘤死亡统计中占首位或第2位［1］。肿瘤转移相关基因(MTA)是最新发现的与癌症进展相关的一个家族，MTA家族的成员包括3种不同的基因(MTA1、MTA2和 MTA3)和已经报道的6种亚型(MTA1、MTA1s、MTA1-ZG29p、MTA2、MTA3 和 MTA3L)［2］。MTA1是这个家族中首先被发现的，已经报道许多人类的肿瘤中MTA1高表达［3］，例如乳腺癌、卵巢癌、肺癌、胃肠系统癌症和结肠直肠癌［4-10］。本研究主要探讨胃癌细胞系以及胃癌临床标本中MTA1的表达情况，以及MTA1在胃癌细胞中的定位情况，为胃癌的治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

Protein marker购自GenScript公司;MTA1抗体购自Santa公司;HRP标记的羊抗鼠IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司;Alexa Fluor 488、DAPI购自Invitrogen公司，ECL发光试剂盒购自GE Healthcare公司;其他试剂均为国产分析纯。

1.2 细胞培养

GES1、BGC803、BGC823、SGC7901、MKN1、MKN45、N87、AGS胃癌细胞株均购自于中国科学院细胞库。细胞均用含有10%胎牛血清的培养基DMEM进行培养，培养至90%融合，进行细胞传代或用于实验。

1.3 蛋白提取

1.3.1 细胞蛋白提取 将细胞铺于6孔板中，培养至90%融合，弃掉培养基，用PBS清洗两遍，在细胞中加入60μl含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液，用橡皮刮刀将细胞缓慢刮下。收集所有液体到新的离心管中，冰上放置10 min，裂解细胞。13 000 g 4℃离心30 min，将上清转到新的离心管中，取上清5μl，选用G250考马斯亮蓝方法进行蛋白定量。

1.3.2 组织蛋白提取 用剪刀将组织剪成小块，冰上操作，快速研磨，根据组织块大小加入含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液，使用细胞超声破碎仪200 W超声破碎5次。冰上静置30 min，13 000 g 4℃离心30 min，将上清转到新的离心管中，取上清5μl，选用G250考马斯亮蓝方法进行蛋白定量。

1.4 Western blot鉴定

将蛋白定量后取20μg总蛋白经10%SDS-PAGE凝胶分离，4℃过夜40 V恒压转移到PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭1 h。用MTA1抗体(1∶500稀释)室温孵育2 h，然后TBST洗膜3次，每次10 min。再用辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠(1∶5 000稀释)二抗孵育2 h，然后TBST洗膜3次，每次10 min。ECL显影。

1.5 共聚焦激光扫描显微镜观察MTA1细胞内定位

将胃癌细胞铺于提前放置好盖片的12孔板中，24 h后用4%多聚甲醛固定15 min，0.1%TritonX100通透细胞膜15 min，山羊血清封闭1 h，anti-MTA1抗体(1∶50稀释)室温孵育 1 h，PBS洗 3次，每次10 min，Alexa Fluor 488(1∶100 稀释)，室温孵育 1 h，PBS洗3次，每次10 min，DAPI(1∶1 000 稀释)，室温孵育20 min，PBS洗3次，每次10 min，使用50%甘油封片。在激光共聚焦显微镜下观察，绿色区域为MTA1蛋白在细胞内的定位，蓝色代表细胞核。

2 结 果

2.1 Western blot检测胃癌细胞系中MTA1蛋白表达的情况

将8种胃癌细胞铺于6孔板中，24 h后收集细胞，提取蛋白，经SDS-PAGE凝胶电泳，Western blot检测蛋白表达(图1)，MTA1蛋白分子质量为82 kDa，GAPDH作为内参，分子质量为36 kDa。在8种胃癌细胞株中，有6种胃癌细胞表达MTA1。

图1 Western blot检测胃癌细胞系中MTA1蛋白表达的情况Fig 1 The expressions of MTA1 were detected by Western blot in the gastric cancer cell lines

2.2 MTA1在胃癌细胞内的定位

通过共聚焦激光扫描显微镜观察MTA1在SGC7901细胞(图2)和 BGC823细胞(图3)内的定位，激发光分别为488 nm(绿色)和340 nm(蓝色)。

2.3 胃癌组织中MTA1蛋白表达的情况

提取组织蛋白，取20μg总蛋白，经SDS-PAGE凝胶电泳，Western blot检测蛋白表达(图4)，MTA1蛋白分子质量为82 kDa，GAPDH作为内参，分子质量为36 kDa，N代表癌旁正常组织，T代表肿瘤组织。11例胃癌标本中有7例高表达MTA1，高表达MTA1比例为63.6%。

图2 激光扫描共聚焦显微镜观察MTA1在SGC7901细胞内的定位Fig 2 Confocal microscopy pictures of SGC7901cells show the subcellular localization of MTA1

图3 激光扫描共聚焦显微镜观察MTA1在BGC823细胞内的定位Fig 3 Confocal microscopy pictures of BGC823 cells show the subcellular localization of MTA1

图4 Western blot检测胃癌组织中MTA1蛋白表达的情况Fig 4 The expressions of MTA1 were detected by Western blot in the gastric cancer tissues

3 讨 论

MTA1是1993年Pencil等［11］应用差异杂交从具有转移潜能的鼠乳腺癌细胞株13762NF中筛选得到的基因。因该基因的表达与乳腺肿瘤转移能力正相关，故命名为MTA1。人MTA1编码715个氨基酸，分子量为82 kDa。MTA1蛋白羧基末端富含脯氨酸，其696～705氨基酸残基序列为LPPRPPPPAP，与SH3结合域 XPXXPPPFXP 或 XpFPpXP 完全配对［12］，为MTA1与信号分子相互作用提供生物化学的基础［13］。

MTA1包含两个二连的核定位信号和一个富含碱性氨基酸的核定位信号［13］。一般而言，MTA蛋白包含碱性的核定位信号，主要定位在细胞核中。通过对小鼠组织的分析，MTA1蛋白存在于多种器官中，包括肺、肝、肾、睾丸，MTA1蛋白的水平是变化的，但是容易检测到，并且提示MTA1在正常的细胞中执行着生理功能［9］。同样，MTA1免疫组织化学的分析证明了在不同的癌组织中MTA1主要定位在核，包括卵巢癌、肺癌、胃癌、结肠直肠癌［13］。但是在肝癌细胞和B细胞淋巴瘤中，MTA1在细胞核和细胞质中都有定位［14］。本研究在8种胃癌细胞中探测MTA1的表达情况，结果显示只有GES1和MKN45两种细胞不表达MTA1。继而选择表达MTA1，并且形态较好适合作免疫荧光实验的SGC7901和BGC823两种细胞，观察MTA1的定位情况，发现在这两种细胞中MTA1主要定位在细胞核中。

转移是癌症患者发病和致死的主要原因，在以细胞为基础的模型和小鼠模型已经确切地证实了MTA1在癌症转移中的重要作用［13］。例如在小鼠乳腺上皮组织中MTA1过表达，能够导致乳腺癌的发生［15］。除了乳腺癌以外，子宫内膜癌微点阵分析，包含70例不同分级的子宫内膜腺癌，其中53例(75.7%)MTA1表达增加［7］。在胃癌的研究中，34例胃癌患者13例(38.2%)MTA1 mRNA高表达。这些发现提示，浆膜侵袭和淋巴结转移与MTA1高表达密切相关，并且更容易发生血管侵袭，侵袭转移是恶性肿瘤的重要生物学行为［16］。不同的实验室和实验方法已经证明了MTA1与许多癌症的发生发展有密切关系，在结肠癌患者中MTA1与淋巴结转移相关，研究发现，MTA1表达水平与某些恶性肿瘤发生、进展、血管生成、转移、侵袭能力及预后密切相关［17］。在关于癌症进展的研究中，MTA1已经成为非常重要的分子之一［3］。本研究中11例胃癌临床标本中检测发现有7例存在MTA1高表达，胃癌组织与癌旁正常组织相比，MTA1表达升高，比例达到63.6%。综上所述，我们认为MTA1将成为癌症治疗的重要靶点。

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