刘天德， 余 新， 袁荣发， 王庆诺， 杨志强， 邵江华，2△

(1南昌大学第二附属医院肝胆外科，2江西省分子医学重点实验室，江西 南昌330006)

Rho 相关含卷曲螺旋蛋白激酶(Rho－associated coiled－coil－containing protein kinase，Rock)是新近发现的Rho/Rock 信号转导通路的关键信号分子，包括Rock1 和Rock2 亚单位［1］，其具有调节细胞的多种行为和功能，并与肿瘤恶性程度、肿瘤发生、转移以及细胞的黏附、收缩、迁移和胞浆的分裂有关［2－3］。研究表明，Rock2 在肝癌等恶性肿瘤中表达水平异常增高［4］。我们的前期研究表明，降低肝癌细胞中Rock2 蛋白表达可以抑制肝癌细胞的增殖，并使细胞周期阻滞在G1/S 期。细胞分裂周期蛋白25A(cell division cycle 25A，Cdc25A)是控制G1/S期调节途径的重要检查点蛋白，在转导级联激活作用中是一个重要的效应分子［5］。也有研究表明，Cdc25A 在肝癌组织中呈现高表达［6］。但Rock2 与Cdc25A 蛋白之间是否存在关联，目前尚不清楚，本研究拟探讨Rock2 对Cdc25A 蛋白的调节作用。

材 料 和 方 法

1 材料

DMEM 培养基(Gibco)，胎牛血清(HyClone)，脂质体LipofectamineTM2000(Invitrogen)，羊抗多克隆Rock2Ⅰ抗(Santa Cruz)，兔抗多克隆Cdc25A Ⅰ抗(Santa Cruz)，兔抗多克隆检查点激酶(checkpoint kinase，Chk)1Ⅰ抗(Santa Cruz)，兔抗多克隆Chk2Ⅰ抗(Santa Cruz)，Protein A/G PLUS－Agarose(Santa Cruz)。DNA 切胶回收试剂盒、质粒大量提取及小量提取试剂盒(北京天根公司)。设计的Rock2 干扰序列及相关引物由上海生工合成。pcDNA5－FRT－6×his－Rock2 质粒及pCMV－N－HA－Cdc25A 质粒已于前期构建，人肝细胞性肝癌细胞株Huh－7 和HepG2 由本实验室保存。

2 标本

收集南昌大学第二附属医院肝胆外科2009 年1月～2010 年7 月肝癌及癌旁组织标本，共计51 例，收集后立即液氮保存。经病理切片证实均为原发性肝癌标本。

3 细胞株的培养及转染

Huh－7 和HepG2 细胞株接种于含10%胎牛血清的DMEM 培养基，37 ℃、5%CO2条件下培养。按脂质体LipofectamineTM2000 转染试剂说明进行转染，于转染6 h 后更换为含10%胎牛血清的DMEM 培养基。……