张 琴 彭 俊 沈 薇 (重庆医科大学附属第二医院消化内科，重庆 40000)

肝X受体(LXRs)可参与机体多种生理活动调节，包括脂肪代谢、胆固醇代谢等〔1，2〕。LXRs包括 LXRα 和 LXRβ 两种亚型，其中前者主要表达于肝脏、脂肪组织等，后者广泛表达于全身各组织〔3〕。在肝脏，LXRα是脂代谢的关键调控点，近年来研究显示乙肝病毒X蛋白(HBx)可通过与LXRα相互作用调节参与脂肪酸和甘油三酯的酶如脂肪酸合酶(FAS)等的转录，从而引起脂代谢紊乱和肝细胞脂肪变性〔4〕。RNA干扰(RNAi)技术是近年来发展起来的一项特异性抑制基因表达的新方法，具有特异性、转染效率高、作用强等优点，已广泛用于抗病毒抗肿瘤等研究〔5〕。我们前期实验提示HBx可以上调LXRα的表达引起肝细胞脂肪变，为了进一步研究HBx的作用机制，本研究拟构建能产生针对LXRα基因的短发夹小干扰RNA(shRNA)真核表达质粒，并用构建质粒转染HepG2.2.15细胞，筛选出高效沉默LXRα基因的序列，将对研究乙肝合并肝脂肪变的发生机制提供有力的工具。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 载体pGenesil-1.1(含hU6启动子、Kan/Neo抗性、EGFP荧光)及大肠杆菌 DH5α(武汉晶赛公司);HepG2.2.15细胞由本实验室保存;T4DNA连接酶、限制性内切酶Eco31I和SacI(Takara公司);通用阴性对照质粒(武汉晶赛公司);质粒小抽提试剂盒(BioRad公司);凝胶DNA回收试剂盒(美国Promega公司);转染试剂PolyJetTM(SignaGen公司);小鼠抗人LXRα单克隆抗体(Abcam公司);山羊抗小鼠β-actin抗体(北京天根公司);总RNA抽提及逆转录试剂盒(Bioteke公司);核蛋白提取试剂盒(凯基生物)，胎牛血清(杭州四季青公司)。

1.2 方法

1.2.1 靶序列的选择 在GenBank中找到LXRα mRNA基因序列(基因NM号:001130101)，通过www.genscript.com网站，根据RNA干扰设计原则设计三个siRNA作用的靶序列(表1)。……