刘春静， 王昌禄， 李风娟， 陈勉华， 王玉荣， 李贞景， 王志芳

(1.天津科技大学理学院，天津 300457;2.天津科技大学食品营养与安全教育部重点实验室/食品工程与生物技术学院，天津 300457)

链霉菌TD-1代谢产物对饲料中污染霉菌的抑制作用及稳定性

刘春静1， 王昌禄2， 李风娟2， 陈勉华2， 王玉荣2， 李贞景2， 王志芳2

(1.天津科技大学理学院，天津 300457;2.天津科技大学食品营养与安全教育部重点实验室/食品工程与生物技术学院，天津 300457)

采用对峙培养法，检测分离于土壤中的链霉菌TD-1代谢产物对饲料中污染霉菌构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、纯绿青霉(Penicillium verrucosum)、赭曲霉(Aspergillus ochraceus)、黄曲霉(Aspergillus flavus)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、茄腐镰刀菌(Fusarium solani)、桔青霉(Penicillum citrinum)、串珠镰刀菌(Fusarium moniliforme)的抑菌活性，结果表明:TD-1菌株代谢产物对以上霉菌具有较强的抑制作用，抑菌带宽度为10 mm左右．通过TD-1菌株的代谢过程曲线发现，该菌株发酵至第6 d抑菌率达90%左右．稳定性试验结果显示:该菌株所产生的活性物质具有较好的耐热性、耐酸碱性、抗紫外辐射能力．

链霉菌;抑菌;污染霉菌;稳定性

随着我国饲料工业的迅猛发展，霉菌对饲料行业造成的损失已引起人们的高度重视．根据联合国粮食组织估算，目前世界上至少有25%的谷物被霉菌毒素污染，每年所造成的经济损失高达数千亿美元［1］．我国霉菌毒素的污染状况更是不容乐观，平均每年损失的饲料占总产量的20%，其中一半以上是由于饲料霉变所致［2］．霉菌毒素的污染及其危害和所造成的经济损失已是不容忽视的问题．

近年来，国内外学者针对饲料中产毒霉菌的防治做了大量的研究［3－9］，各种防霉措施、脱毒方法不断出现，已取得了一定的成效，但无论哪一种方法或产品，都存在脱毒不彻底，添加量较大，费用较高，破坏或吸附饲料营养，影响饲料适口性等某方面的局限性，所以，新方法的研究仍是一个重要的研究内容［10－11］．

微生物源天然防霉剂因其资源丰富，防治效果好，生产工艺简单而受到各国的青睐［12－15］．目前，市场上出现的防霉剂难以对饲料中所有的污染霉菌起到抑制作用，采用单一措施很难取得良好的防治效果．因此，开发复合型天然防霉剂，提高防霉剂的使用效果，研制无毒副作用、无残留的绿色环保型饲料防霉剂将成为今后研究和开发的热点．本研究拟对从土壤中分离得到的TD-1菌株抑制9种污染霉菌的作用及其发酵液中活性物质的稳定性进行研究，希望为新型防霉剂的开发提供实验依据．

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

拮抗菌TD-1，分离筛选自天津市宝坻区某饲料厂附近土壤中，经中国科学院微生物研究所鉴定，TD-1菌株为链霉菌(Streptomyces sp．)．

污染霉菌:构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、纯绿青霉(Penicillium verrucosum)、赭曲霉(Aspergillus ochraceus)、黄曲霉(Aspergillus flavus)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、茄腐镰刀菌(Fusarium solani)、桔青霉(Penicillum citrinum)、串珠镰刀菌(Fusarium moniliforme)，由天津市畜牧兽医研究所提供．

1.1.2 培养基

高氏一号合成培养基:可溶性淀粉，20.0 g;NaCl，0.5 g;FeSO4·7H2O，0.01 g;MgSO4·7H2O，0.5 g;KNO3，1 g;K2HPO4，0.5 g;琼脂，200 g;蒸馏水，1 000 mL;调节pH值为7.2～7.4．

TD-1液体发酵培养基:可溶性淀粉，20.0 g;黄豆粉，10.0 g;KNO3，1.0 g;K2HPO4，0.5 g;NaCl，0.5 g;MgSO4·7H2O，0.5 g;FeSO4·7H2O，0.01 g;蒸馏水1 000 mL;pH 值为 7.2 ～7.4［16］．

马铃薯浸汁琼脂(PDA)培养基:称取去皮马铃薯200.0 g，切成小块，加入1 000.0 mL水煮沸30 min，用双层纱布滤成清液．加自来水至1 000.0 mL，加入20.0 g葡萄糖完全溶解，pH值自然．

以上培养基灭菌条件为121℃，20 min．

1.2 方法

1.2.1 TD-1菌株对9种污染霉菌的抑菌活性测定

污染霉菌菌饼的制备:将污染霉菌接种于PDA培养基平板上，28℃培养4 d，待菌落长满整个平板后用打孔器打成直径为0.8 cm的菌饼备用．

抑菌活性的测定:制备PDA培养基平板，采用对峙培养法［16－17］，在平板上以原点为中心划十字线，在中心处点接TD-1菌株，28℃培养3 d，在两条直线两端距中心相同距离接种污染霉菌菌饼，勿与TD-1相连，28℃培养4 d，用直尺测量抑菌带宽度．

1.2.2 TD-1菌株的生长及代谢特性的测定

将TD-1菌株在高氏一号斜面上活化，加入无菌生理盐水制成菌悬液，备用．

1.2.2.1 菌株生长曲线的绘制

按体积分数为10%接种量，将制备的TD-1菌悬液接种至装有50 mL TD-1液体发酵培养基的250 mL三角瓶中，28℃，180 r/min摇床中培养3 d，在不同时间取样，测定菌丝体质量，重复3次．以培养时间为横坐标，菌丝体质量为纵坐标，绘制TD-1菌株生长曲线．

1.2.2.2 菌株代谢产生抑菌活性物质特性的测定

按体积分数为10%接种量，将制备的TD-1菌悬液接种至装有100 mL TD-1液体发酵培养基的250 mL三角瓶中，28℃，180 r/min摇床中培养，每隔24 h取样，以串珠镰刀菌为指示菌，测定抑菌率变化［18］．

采用生长速率法测定抑菌率［19－20］．按体积分数为10%接种量，将制备的TD-1菌悬液加到装有100 mL TD-1液体发酵培养基的250 mL三角瓶中，28℃摇床(180 r/min)培养5～6 d，10 000 r/min离心15 min，取上清液，过0.22 μm无菌滤膜，滤液备用．取无菌滤液5 mL加入培养皿中，将20 mL冷却至50℃左右的PDA培养基倒入培养皿中与滤液混合均匀，冷却后接入串珠镰刀菌菌饼，28℃培养，以不加TD-1无菌滤液平板接种的串珠镰刀菌菌落作对照．24 h后测量串珠镰刀菌的菌落直径，计算串珠镰刀菌菌丝生长抑制率．

式(1)中，D1为对照菌落生长直径，mm;D2为处理菌落生长直径，mm;D3为串珠镰刀菌菌饼直径，mm．

1.2.3 TD-1菌株产生的抑菌活性物质稳定性测定

1.2.3.1 活性物质粗提液的制备

将TD-1菌株在高氏一号斜面上活化，制成菌悬液，按10%接种量加入装有100 mL TD-1液体发酵培养基的250 mL三角瓶中，28℃摇床培养(180 r/min)5 ～6 d，10 000 r/min离心15 min，取上清液过0.22 μm无菌滤膜，滤液备用．

1.2.3.2 热、酸、碱及紫外线处理

取30 mL TD-1菌株发酵上清液18份进行处理［21－22］，结果见表 1．

表1 热、酸碱、紫外线、保存时间处理条件Tab．1 Treatment conditions of heat，acid and alkali，UV，storage time

以 3 mol·L－1HCl和 3 mol·L－1NaOH 调节 pH值至最初数据为8.1，以串珠镰刀菌为指示菌，采用生长速率法检测各种处理条件下TD-1菌株抑菌活性，测定生长直径大小，计算抑菌率．60，80，100℃加热在水浴锅中进行，121℃处理在高压灭菌锅中进行．紫外照射处理在紫外诱变箱中进行，将发酵上清液倒入培养皿中，打开皿盖照射，照射高度为20 cm．各实验重复3次．

2 结果与讨论

2.1 TD-1菌株对9种污染霉菌的抑制效果

按1.2.1方法，分别以黄曲霉(Aspergillus flavus)、桔青霉(Penicillum citrinum)、茄腐镰刀菌(Fusarium solani)、赭曲霉(Aspergillus ochraceus)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、构巢曲霉(Aspergillus nidu-lans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、纯绿青霉(Penicillium verrucosum)、串珠镰刀菌(Fusrium moniliforme)作为指示菌，检测TD-1菌株对9种供试菌的抑菌效果，结果见表2．

从表2中可以看出，TD-1菌株发酵液对9种污染霉菌均有很强的抑制作用，抑菌带宽度为10 mm左右．其抑菌效果见图1．

2.2 TD-1菌株的生长及代谢规律

2.2.1 TD-1菌株生长曲线绘制

按1.2.2.1方法研究TD-1菌株生长规律，结果如图2．

表2 TD-1菌株对9种污染霉菌的抑菌效果Tab．2 Inhibition effects of TD-1 on 9 strains of toxic molds mm

图1 TD-1菌株对9种供试霉菌的抑制效果Fig．1 Inhibition effects of TD-1 on 9 kinds of molds

从图2中可以看出，TD-1菌株在发酵第6 d菌质量达到最大值，随后逐渐降低，最后稳定在0.65 g左右，说明TD-1菌株在第6 d生长达到峰值．

2.2.2 TD-1菌株代谢过程中抑菌率变化

按1.2.2.2方法研究TD-1菌株在发酵过程中产生的抑菌活性物质变化，结果见图3．

从图3中可以看出，TD-1菌株在液体培养基中培养前2 d对串珠镰刀菌没有抑制活性，表明未产生抑菌物质，2 d后菌株开始产生抗菌物质，并且迅速增多，到6 d时抑制率达到最大值，随后抑制率又开始下降，最后抑菌率维持在90%左右．

2.3 菌株产生的抑菌活性物质稳定性分析

2.3.1 温度对TD-1发酵液抑菌活性的影响

按1.2.3.2方法研究温度对TD-1发酵液抑菌活性的影响，结果见图4．

从图4中可以看出，经 60，80，100，121℃处理30 min，以及121℃处理60 min后，TD-1菌株发酵液抑菌活性与未处理相比明显提高，说明发酵液中的抗菌物质具有较强的热稳定性．

图2 TD-1菌株的生长曲线Fig．2 Growth curve of strain TD-1

图3 TD-1菌株代谢产物对串珠镰刀菌的抑制作用Fig．3 Inhibition effects of fermentation metabolite of TD-1 on Fusarium moniliforme

图4 温度对TD-1菌株发酵液抑菌活性的影响Fig．4 Effects of temperature on antibacterial activity of TD-1 fermented broth

2.3.2 酸碱对TD-1发酵液抑菌活性的影响

按1.2.3.2方法，将TD-1发酵滤液调节至pH值为3和pH值为10，并分别经121℃处理30 min，除在pH值为10未加热处理条件下抑菌活性无明显变化外，其他条件下的抑菌活性与未处理相比显著提高，见图5，说明TD-1菌株产生的活性物质具有较强的耐酸、碱性，其原因有待进一步研究．

图5 pH值对TD-1发酵液抑菌活性的影响Fig．5 Effects of pH on antibacterial activity of TD-1 fermented broth

2.3.3 紫外线对TD-1发酵液抑菌活性的影响

按1.2.3.2方法，研究紫外线照射对TD-1发酵液抑菌活性的影响，结果见图6．图6表明，经2，6，12，24 h紫外灯照射后，TD-1菌株发酵液的抑菌能力没有减弱却有提高，说明TD-1菌株发酵液对紫外线照射的稳定性较好．

图6 紫外线对TD-1发酵液抑菌活性的影响Fig．6 Effects of ultraviolet on antibacterial activity of TD-1 fermented broth

2.3.4 保存时间对TD-1发酵液抑菌活性的影响

将TD-1菌株发酵液滤液放置于30℃，保存0～50 d发现，发酵液滤液抑菌率在20 d以后才略有下降，见图7．

3 结论

从土壤中分离筛选到的TD-1菌株抑菌谱广，对污染饲料的串珠镰刀菌、黄曲霉、桔青霉、茄腐镰刀菌、赭曲霉、米曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、纯绿青霉均具有较强的抑制作用．在目前产毒霉菌的防治研究中，能同时抑制9种污染霉菌生长的拮抗菌株较少，因此，TD-1菌株及产生的抗菌活性物质具有一定的研究意义和潜在的应用价值．

图7 保存时间对TD-1发酵液抑菌活性的影响Fig．7 Effects of storage time on antibacterial activity of TD-1 fermented broth

通过测定TD-1菌株生长规律和抑菌活性物质的变化情况，可以确定TD-1菌株在发酵第2～3 d开始产生抑菌活性物质，第6 d达到最大值，为该菌株代谢产生的抑菌活性物质的提取提供了依据．

对TD-1菌株所产抑菌活性物质稳定性初步研究结果显示，经加热、酸碱及紫外灯照射处理后，其抑菌活性无明显变化，表明该抑菌活性物质具有较好的热稳定性、酸碱稳定性和较强的抗紫外线辐射特性．这些特性为微生物源天然防霉剂的开发提供了实验依据．

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(责任编辑:叶红波)

Inhibition and Stability of Metabolic Products by Streptomyces sp．TD-1 to Mold of Feed Contamination

LIU Chun-jing1， WANG Chang-lu2， LI Feng-juan2， CHEN Mian-hua2，WANG Yu-rong2， LI Zhen-jing2， WANG Zhi-fang2
(1.College of Science，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China;2.Key Laboratory of Food Nutrition and Safety，Ministry of Education/School of Food Engineering and Biological Technology，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China)

Metabolites of Streptomyces sp．TD-1 were reported with obvious inhibiting effects to Fusarium moniliforme，Aspergillus nidulans，Penicillium verrucosum，Aspergillus ochraceus，Aspergillus flavus，Aspergillus niger，Aspergillus oryzae，Fusarium solani and Penicillum citrinum with the size of inhibition zone of about 10 mm．The metabolic chart of growth process of TD-1 strain showed that the growth amounted to the maximum，and the inhibition rates reached to 90%at the 6th day．Stability test showed that the antimicrobial compounds produced by TD-1 strain had good thermo and pH stability，and strong anti-UV ability．

Streptomyces sp．;inhibition effects;contaminated mold;stability

TS201.2

A

1671-1513(2012)04-0054-05

2012-03-07

刘春静，女，助理实验师，硕士，主要从事仪器分析方面的工作;

王昌禄，男，教授，博士生导师，主要从事食品生物技术方面的研究．通讯作者．