王利利，刘彩红，朱亚勤

（教育部医学细胞生物学重点实验室，细胞病理生物学研究室，中国医科大学基础医学院细胞生物学教研室，沈阳110001）

Twist是一种高度保守的碱性螺旋-环-螺旋结构的转录因子，最早在果蝇体内被发现。在幼稚中胚层细胞和中胚层起源器官中表达最多，出生后降至低水平［1，2］。研究表明，Twist在分化过程中起到重要作用。越来越多的证据显示，TWIST还参与人类多种肿瘤的发生发展过程。某些肿瘤中TWIST的高表达与其临床分期以及较差的预后相关［3～5］。同时，在体内，TWIST高表达的肿瘤细胞系有较强的转移能力；在体外，TWIST可诱发细胞发生上皮向间质转化［6］、增强细胞生存能力［7］、诱发血管生成［8］、提高肿瘤细胞对化疗药物的抵抗能力［9］。目前发现TWIST的下游靶基因（如E-钙粘素、N-钙粘素等）与肿瘤的发生发展相关，但其具体机制尚不清楚。

Twist基因GC含量高达75%，甚至局部区域GC含量高达90%以上，其中有连续的30个GC，具有复杂的二级结构。GC含量高达70%以上时，利用PCR很难理想地进行扩增。主要因为G、C之间形成三对氢键，解链所需能量较高，故模板较难解链。在常规变性温度下，DNA模板变性不完全，同时由于单链的GC丰富区易自身互补配对形成稳定的发夹环二级结构，而使PCR引物难于结合到模板上，DNA聚合酶也难于延伸或停止延伸，结果常出现严重的非特异性条带，甚至导致靶基因扩增失败。本研究中我们比较3种DNA聚合酶，经优化，选择Platinum pfx DNA聚合酶作为高GC基因Twist扩增DNA聚合酶，配合优化的PCRx加强缓冲……